Uso di un microarray antigeno influenzale per misurare l'ampiezza degli anticorpi del siero attraverso i sottotipi di virus
Summary
Presentiamo un protocollo per l’utilizzo di un microarray proteico costruito stampando antigeni influenzali su vetrini rivestiti di nitrocellulosa per sondare simultaneamente il siero per più isotipi anticorpi contro oltre 250 antigeni provenienti da diversi ceppi di virus, quindi consentendo la misurazione dell’ampiezza degli anticorpi del siero attraverso i sottotipi di virus.
Abstract
Il virus dell’influenza rimane una causa significativa di mortalità in tutto il mondo a causa della limitata efficacia dei vaccini attualmente disponibili. Una sfida fondamentale per lo sviluppo di vaccini universali per l’influenza è l’elevata diversità antigenica derivante dalla deriva antigenica. Il superamento di questa sfida richiede nuovi strumenti di ricerca per misurare l’ampiezza degli anticorpi del siero diretti contro molti ceppi di virus in diversi sottotipi antigenici. Qui presentiamo un protocollo per analizzare l’ampiezza degli anticorpi del siero contro diversi ceppi di virus influenzali utilizzando una microarray proteica di antigeni influenzali.
Questo microarray antigene influenzale è costruito stampando antigeni di emagglutinina e neuraminidasi purificati su una membrana rivestita di nitrocellulosa utilizzando una stampante microarray. Le sera umane vengono incubate nel microarray per legare anticorpi contro gli antigeni influenzali. Gli anticorpi secondari coniugati quantici vengono utilizzati per rilevare simultaneamente gli anticorpi IgG e IgA che si legano a ciascun antigene sul microarray. Il legame quantitativo degli anticorpi viene misurato come intensità di fluorescenza utilizzando un imager portatile. I risultati rappresentativi sono mostrati per dimostrare la riproducibilità del saggio nella misurazione degli anticorpi influenzali specifici del sottotipo e intergovernativi nella sera umana.
Rispetto ai metodi tradizionali come ELISA, il microarray di antigeni influenzali fornisce un approccio multiplexed ad alta produttività in grado di testare centinaia di marini per isotipi anticorpi multipli contro centinaia di antigeni in un breve lasso di tempo, e quindi ha applicazioni nello sviluppo di sero-sorveglianza e vaccini. Una limitazione è l’incapacità di distinguere gli anticorpi leganti dagli anticorpi neutralizzanti.
Introduction
Il virus dell’influenza è responsabile di una perdita di 20 milioni di anni di vita all’anno a cause di morte o disabilità, tra cui l’1% di tutti i decessi in tutto il mondo ogni anno, con impatti sproporzionati sugli anziani e sulle popolazioni dei tropici e del mondo in via di sviluppo1, 2,3. Oltre al carico di malattie delle epidemie stagionali, l’emergere di nuovi ceppi influenzali attraverso il riassortimento genetico sia naturalmente negli ospiti comuni che artificialmente per il bioterrorismo potrebbe portare a pandemie in tutto il mondo con rapida diffusione e elevata letalità 4 DEL psu’ , 5. Mentre sono attualmente disponibili numerosi vaccini antinfluenzali,la loro efficacia è limitata dalla specificità del sottotipo 6, creando la necessità di sviluppare vaccini antinfluenzali universali che conferiscono un’immunità duratura contro più virus ceppi7.
Una sfida fondamentale per lo sviluppo di vaccini universali per l’influenza è l’elevata diversità antigenica tra i ceppi. La specificità antigenica degli attuali vaccini combinata con la variazione antigenica dei virus circolanti crea un disallineamento tra ceppi di vaccino e ceppi circolanti. Questo conferisce un vantaggio evolutivo che favorisce un’ulteriore deriva genetica dai ceppi di vaccino durante un’epidemia, limitando l’efficacia del vaccino spesso a meno del 50%8,9. Un’ulteriore fonte di mancata corrispondenza antigenica sono le mutazioni virali adattive alle uova generate durante la produzione di vaccini, che portano ad anticorpi che si legano male ai virus circolanti10,11.
Superare questa sfida di elevata diversità antigenica richiederà nuovi strumenti di ricerca per caratterizzare l’ampiezza delle risposte immunitarie preesistenti e suscitate attraverso varianti antigeniche clinicamente rilevanti in campioni di siero e mucosali. Attualmente i metodi disponibili, tra cui l’inibizione dell’emagglutinazione (HAI), la microneutralizzazione (MN) e la tradizionale ELISA, si limitano a rilevare anticorpi contro un singolo ceppo di virus alla volta, quindi il loro uso per il rilevamento di più isotipi di anticorpi contro più ceppi di virus esaurisce rapidamente le risorse cliniche e di laboratorio disponibili. Inoltre, HAI e MN richiedono una coltura di virus dal vivo disponibile solo in laboratori specializzati.
Microarray proteici, potenzialmente costituiti da migliaia di antigeni stampati su vetrini rivestiti di nitrocellulosa come mostrato nella Figura 1, possono soddisfare questo bisogno12. Questi microarray possono essere prodotti e sondati in modo ad alta produttività consumando piccole quantità di campioni clinici per determinare i livelli quantitativi di isotipo/sottotipo degli anticorpi rispetto a ogni singolo antigene sulla matrice. Questo approccio alla scoperta di antigeni è stato applicato allo sviluppo diagnostico e del vaccino contro più patogeni infettivi13. Ad oggi, abbiamo prodotto microarray proteici per oltre 35 patogeni, tra cui oltre 60.000 proteine espresse totali, e li abbiamo usati per sondare oltre 30.000 sera umani da individui infetti e di controllo. Una piattaforma di imaging portatile recentemente sviluppata per diapositive microarray ha reso questa metodologia più accessibile all’utente finale14.
Sulla base di un ampio lavoro precedente di più contributori nel campo15,16,17 ,18,19, è stato recentemente sviluppato un microarray di proteine influenzali che contiene oltre 250 varianti antigeniche emagglutinina purificata (HA) con rappresentazione di tutti i 18 sottotipi12,20. Utilizzando questa metodologia, è stata dimostrata un’infezione influenzale naturale per generare anticorpi IgG e IgA ampiamente reattivi contro sottotipi di HA correlati ai filogeneticamente, mentre una vaccinazione all’influenza intramuscolare ha generato solo IgG specifico per sottotipo anticorpi21. Tuttavia, è stato dimostrato che l’aggiunta di un adiuvante che attiva i recettori simili a i pedaggio ai vaccini antinfluenzali amplia la risposta degli anticorpi IgG suscitata attraverso i sottotipi di HA negli studi sugli animali22.
Questo microarray è attualmente utilizzato per sondare sera raccolti da un prospettiva di studio di coorte di studenti universitari che sono stati seguiti per l’infezione influenzale. Qui, viene riportata la metodologia del microarray di antigene influenzale con dimostrazione della riproducibilità del saggio per rilevare anticorpi specifici e cross-reattivi specifici del sottotipo in un sottoinsieme di campioni di questo studio.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il protocollo di microarray dell’antigene influenzale qui descritto è adattabile a qualsiasi progetto che richieda l’analisi delle risposte degli anticorpi a molti antigeni. La piattaforma di microarray può essere utilizzata con qualsiasi set desiderato di antigeni proteici espressi in qualsiasi sistema in grado di raggiungere 0,1 mg/mL o una resa superiore con o senza purificazione, come descritto in precedenza12. Se gli antigeni proteici non purificati (ad esempio, espressi nel sistema di trascrizione e traduzione in vitro) vengono utilizzati direttamente per stampare microarray, i componenti del sistema di espressione proteica (ad esempio, E. coli lysato) devono essere aggiunti 1:10 al buffer di blocco utilizzato per diluizione di sera e anticorpi di controllo della qualità al fine di bloccare eventuali anticorpi diretti contro questi componenti. Le configurazioni delle diapositive sono disponibili con un numero inferiore di pastiglie più grandi su ogni diapositiva per contenere un numero maggiore di antigeni per array. Per questo studio, abbiamo utilizzato una stampante microarray GeneMachines OmniGrid 100 che utilizza perni che contattano direttamente la superficie della nitrocellulosa per depositare punti sull’array. Anche se questa stampante microarray non è più disponibile in commercio, altre stampanti microarray disponibili in commercio possono essere utilizzate in questo protocollo, ma possono richiedere pin personalizzati (sia a contatto che senza contatto) e software e devono avere una risoluzione spot sufficiente e compatibilità con diapositive e imager. A seconda della reattività di sera, è possibile utilizzare diluizioni da 1:50 a 1:400. Il buffer senza siero può essere utilizzato come controllo negativo, mentre gli anticorpi monoclonali noti per legarsi all’antigene possono essere usati come controllo positivo.
Gli utenti devono essere a conoscenza di alcuni problemi di risoluzione dei problemi. Lo scopo del controllo di qualità utilizzando anticorpi al suo tag è quello di verificare la presenza di eventuali antigeni per i quali la stampa non ha avuto successo. Tutti i punti che danno costantemente un segnale basso nel controllo di qualità di più array probabilmente rappresentano un antigene insufficiente stampato. I motivi possibili includono l’aggregazione o la precipitazione o l’antigene nella lastra di origine o uno scarso contatto tra il perno di stampa e lo scivolo microarray a causa dello spessore variabile del pad di nitrocellulosa. A questo punto, non eseguiamo la normalizzazione di analisi basata sui risultati quantitativi del controllo di qualità, dato che il legame rilevato degli anticorpi può essere influenzato dalla disponibilità di questo tag, che dipende dalla conformazione tridimensionale specifica per ogni antigene.
Il microarray antigene influenzale offre diversi vantaggi rispetto ai metodi tradizionali come ELISA ed è complementare a saggi funzionali come HAI e MN. Il microarray proteico a 16 pad è una tecnologia di risparmio di campioni con capacità di misurare simultaneamente anticorpi di isotipi multipli contro circa 300 antigeni provenienti da 1 l di siero. Il numero di antigeni può essere aumentato a migliaia diminuendo il numero di pastiglie per diapositive. L’analisi multiplex attina consente inoltre di risparmiare tempo e risorse di consumo, dato che centinaia di sera possono essere sondati per anticorpi in 2 giorni, e tutti i materiali diversi da vetrini e reagenti sono riutilizzabili in modo da non generare grandi quantità di rifiuti di plastica.
Mentre le stampanti microarray potrebbero non essere ampiamente distribuite, i vetrini microarray possono essere stampati in una posizione centralizzata e quindi trasportati all’utente finale per il sondaggio. L’unica attrezzatura necessaria per il sondaggio è l’imager portatile e a basso costo. L’obiettivo della diffusione di questo protocollo è quello di rendere più diffuso l’utilizzo di questa tecnica.
I principali limiti del microarray antigene influenzale sono l’incapacità di caratterizzare la funzione e la cinetica degli anticorpi rilevati. Il microarray sta rilevando un insieme policlonale di anticorpi leganti per ogni antigene. Questi anticorpi possono o non possono essere funzionali nella neutralizzazione del virus nei saggi HAI e MN. Tuttavia, i saggi HAI e MN richiedono una coltura di virus vivo con la necessità di strutture specializzate con armadi di biosicurezza di alto livello per testare gli anticorpi contro i sottotipi di influenza aviaria, mentre il microarray proteico non coinvolge il virus vivo componenti in modo che possano essere utilizzati in qualsiasi laboratorio di base. Per quanto riguarda la cinetica legante, una singola diluizione di siero sondato con un array contenente una singola concentrazione di ogni antigene produce un singolo punto dati, che rappresenta un composto di quantità e affinità riassunte su tutti gli anticorpi che si legano all’antigene . Per risolvere completamente la cinetica legante antigene-anticorpo, sono necessarie concentrazioni multiple di antigeni e/o diluizioni seriali di sera.
Nonostante queste limitazioni, il microarray dell’antigene influenzale è uno strumento utile per caratterizzare l’ampiezza degli anticorpi influenzali in tutto il paesaggio antigenico che possono integrare i saggi funzionali che sono più limitati in termini di produttività e disponibilità.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori desiderano riconoscere il professor Don Milton (Institute of Applied Public Health, University of Maryland, College Park, MD, USA) per aver raccolto la sera umana nell’ambito del protocollo IRB dell’Università del Maryland #313842 finanziata dal DARPA N66001-18-2-4015 P00001. Gli autori vorrebbero anche riconoscere il prof. S. Khan è parzialmente supportato dal National Center for Research Resources e dal National Center for Advancing Translational Sciences, National Institutes of Health, attraverso la sovvenzione KL2 TR001416. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresenta necessariamente le opinioni ufficiali della NIH.
Materials
| 16-pad nitrocellulose-coated glass slides | Grace Bio Labs | 305016 | |
| 1x GVS FAST blocking buffer | Fischer Scientific | 10485356 | |
| ArrayCam portable imager | Grace Bio Labs | 400S | Other imaging devices can be used to visualize slides if capable of achieving the resolution of the microarray spots and the excitation and emission wavelengths of the quantum dots. |
| Biotin-conjugated goat anti-mouse-IgG antibody | Thermo Fischer | 31800 | |
| HiBase 384-well plate | Greiner Bio-One | T-3037-11 | |
| Microarray pins | ArrayIt | GMP2 | Each different microarray printer may require its own custom microarray pins. |
| Mouse monoclonal poly-His antibody | Sigma-Aldrich | H1029 | |
| OmniGrid 100 microarray printer | GeneMachines | The version of the microarray printer used in this work is no longer commercially available, but the updated similar equipment is the OmniGrid Accent microarray printer from Digilab (Hopkinton, MA), and the same protocol can be carried out with most commercially available microarray printers. | |
| ProPlate slide chambers | Grace Bio Labs | 246890 | |
| ProPlate slide clips | Grace Bio Labs | 204838 | |
| ProPlate slide frames | Grace Bio Labs | 246879 | |
| Quantum dot 585 nm conjugated goat anti-human-IgA antibody | Grace Bio Labs | 110620 | |
| Quantum dot 585 nm streptavidin conjugate | Thermo Fischer | Q10111MP | |
| Quantum dot 800 nm conjugated goat anti-human-IgG antibody | Grace Bio Labs | 110610 |
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