Cortisol-Extraktion aus Störflossen und Kieferknochenmatrizen
Summary
In dieser Studie stellen wir ein Protokoll zur Cortisolextraktion aus der Flosse und dem Kieferknochen von Störarten vor. Der Fin- und Kieferknochen-Cortisolspiegel wurde weiter untersucht, indem zwei Waschlösungsmittel mit anschließenden ELISA-Assays verglichen wurden. Diese Studie untersuchte die Durchführbarkeit von Kieferknochen-Cortisol als neuartigen Stressindikator.
Abstract
Ziel dieser Studie war es, eine Technik zur Extraktion von Cortisol aus Störflossen unter Verwendung von zwei Waschlösungsmitteln (Wasser und Isopropanol) zu entwickeln und unterschiede in den Fin-Cortisol-Spiegeln zwischen drei Hauptstörarten zu quantifizieren. Die Flossen wurden von 19 geopferten Stören geerntet, darunter sieben Beluga (Huso huso), sieben Sibirien (Acipenser baerii) und fünf sevruga (A. stellatus). Die Störe wurden in iranischen Farmen für 2 Jahre (2017-2018) aufgezogen, und Cortisol-Extraktionsanalyse wurde in Südkorea durchgeführt (Januar-Februar 2019). Kieferknochen aus fünf H. huso wurden auch zur Cortisolextraktion verwendet. Die Daten wurden mit dem allgemeinen linearen Modellverfahren (GLM) in der SAS-Umgebung analysiert. Die Intra- und Inter-Assay-Variationskoeffizienten betrugen 14,15 bzw. 7,70. Kurz gesagt, die Cortisol-Extraktionstechnik beinhaltete das Waschen der Proben (300 x 10 mg) mit 3 ml Lösungsmittel (Ultrarinduzess und Isopropanol) zweimal, Rotation bei 80 Umdrehungen für 2,5 min, Lufttrocknung der gewaschenen Proben bei Raumtemperatur (22-28 °C) für 7 Tage, weitere Trocknung die Proben mit einem Perlenschlag bei 50 Hz für 32 min und Schleifen sie in Pulver, auftragen 1,5 ml Methanol auf das getrocknete Pulver (75 x 5 mg), und langsame Rotation (40 Rpm) für 18 h bei Raumtemperatur mit kontinuierlichem Mischen. Nach der Extraktion wurden probenweise zentrifugiert (9.500 x g für 10 min), und 1 ml Überstand wurde in ein neues Mikrozentrifugenrohr (1,5 ml) übertragen, bei 38 °C inkubiert, um das Methanol zu verdampfen, und mittels enzymgebundenem Immunsorben-Assay (ELISA) analysiert. . Es wurden keine Unterschiede im Fin-Cortisol-Spiegel zwischen den Arten oder in den Fin- und Kieferknochen-Cortisolspiegeln zwischen Waschlösungsmitteln beobachtet. Die Ergebnisse dieser Studie zeigen, dass die Stör-Kieferknochenmatrix ein vielversprechender alternativer Spannungsindikator für feste Matrizen ist.
Introduction
Cortisol ist ein zuverlässiger Indikator für tierischen Stress. Cortisol-Extraktion bietet einen gültigen Rahmen für Forscher, um Stressniveaus und allgemeine Muster in Stressoren zu überwachen. Zum Beispiel haben frühere Studien methodische Validierung von Haarcortisol-Messungen mit verschiedenen Methoden beim Menschendurchgeführt 1,2, Affen3,4, Rinder5, Schafe6, und Goldfisch7,8. Bei Fischarten haben Cortisolmessungen in Matrizen wie Schuppen, Hautschleim, Kot und Blut9 gezeigt, dass sie Informationen über die Gesundheit von Fischen liefern. Wenn die Blutentnahme problematisch ist oder Schuppen fehlen, sind alternative Matrizen für die Cortisolextraktion erforderlich. Bei Fischen können alternative Matrizen den Kieferknochen enthalten, ein hartes Gewebe ähnlich dem menschlichen Zahn10.
Die Entwicklung neuer Matrizen und validierter Techniken zur Bestimmung des Fischstressniveaus ist für die Kaviarindustrie von besonderem Interesse, wo Störe eine längere Exposition gegenüber Umweltstressfaktoren erfahren können11. Das Geschlecht von Stören kann nicht vor 2 Jahren bestimmt werden, und Stör haben keine Schuppen. Da sich Cortisol während der Wachstumsphase nach und nach in festen Matrizen ansammelt, könnten7,12, Langzeit-Cortisolakkumulationsdaten von harten Matrizen wie Flossen und Kieferknochen Einen Einblick in Stress geben in verschiedenen Wachstumsstadien. Im Gegensatz dazu bieten die Cortisolspiegel im Blut eine Momentaufnahme des Stressniveaus zum Zeitpunkt des Todes und können Stress während der Langzeitpflege bedingungen nicht genau darstellen13,14. Angesichts des zunehmenden Wettbewerbs auf dem Kaviarmarkt sind neue Ansätze zur Verbesserung der Stressbedingungen für die Produktion gesünderer Eier bei Störarten während der Langzeitaufzucht (8-12 Jahre oder länger) ein immer wichtigerer Forschungsbereich. Aufgrund der hohen Kosten für Störe sind geerntete Proben extrem kostspielig (8.000-15.000 DOLLAR pro ausgereiftem Fisch je nach Art und Wachstumsstadium), ein begrenzender Faktor für Forschungsprojekte. Die Entwicklung einer geeigneten Technik zur Cortisolextraktion aus Störflossen und Kieferknochen könnte jedoch sowohl auf Fischzuchtsysteme als auch auf Wildfische sinnvoll angewandt werden, um die Qualität und Ernte von Störeiern sowohl für den Verzehr als auch für die erhaltung.
Neben der Bereitstellung zuverlässiger Ergebnisse6ist die Auswahl einer geeigneten Cortisolextraktionstechnik von entscheidender Bedeutung, um sicherzustellen, dass andere Verbindungen, die in der Matrix während der Probenvorbereitung vorhanden sind, den Output nicht verwirren, was zu inkonsistente Ergebnisse. Ebenso wichtig ist es zu bestimmen, ob der Gehalt an Flossen- und Kieferknochen-Cortisol durch Hormonspiegel im umgebenden Wasser beeinflusst wird. Heimbürge et al.15 schlugen vor, dass eine Reihe von Faktoren Cortisolspiegel beeinflussen können, einschließlich Alter, Geschlecht, Schwangerschaft, Jahreszeit, Farbe12und Körperregion, aus der Cortisol extrahiert wird16. Es liegen jedoch nur wenige Informationen über die Auswirkungen des Waschens von Lösungsmitteln auf die Cortisolextraktion in Fischkörpermatrizen8 vor,und keine über diese Effekte bei Stören, mit Ausnahme von Störeiern17.
Obwohl die Analyse der Cortisolspiegel der Basisvon Fischen und Kieferknochen von Stören erfordert, dass die Fische eingeschläfert werden, beinhaltet dieser Ansatz nicht die invasiven Techniken, die für die Blutentnahme bei lebenden Stören erforderlich sind. Flossen- und Kieferknochenproben lassen sich leicht sammeln, und die Extraktion aus diesen Geweben kann schnell durchgeführt werden. In ähnlicher Weise, Hormonextraktion und Analyse sind einfach und erfordern wenig spezielle Ausrüstung.
In dieser Studie stellen wir eine neue und leicht anzuwendende Technik zur Extraktion, Zumwaschung und Bestimmung von Cortisol aus Fischflossen und Kieferknochen vor, mit dem Ziel, zu bestimmen, ob cortisolspiegel, die aus diesen Matrizen gemessen werden, zuverlässig als Spannung verwendet werden können. Indikatoren. Die Vorteile dieser Technik sind ein einfacher und nicht-invasiver8-Ansatz, weniger Datenvariation und zuverlässige Ausgabe1,6,8,17; die Technik ist auf Fischarten ohne Schuppen wie Stör anwendbar. Die Technik erfordert die Schlachtung der Fische, Auswahl der geeigneten Waschlösungsmittel2,4, richtiges Schleifen der Proben3,5, professionelle enzymgebundene Immunosorbent Assay (ELISA) Anwendung5,7, und umfangreiche Kenntnisse der Einbeziehung von Cortisolquellen in feste Matrizen6.
Wir haben zwei verschiedene Waschlösungsmittel (Ultrarinrwasser und Isopropanol) angewendet, um Basalcortisolspiegel in Flossen von drei Störarten zu erhalten: beluga (Huso huso), Siberian (Acipenser baerii) und sevruga (A. stellatus ), unter den üblichen Umweltbedingungen für jede Art. Kieferknochen von H. huso wurden auch verwendet, um Stress in Stören zu bewerten. Dies ist die erste Studie, die Cortisolspiegel in Störkieferknochen misst. Die Ergebnisse dieser Studie werden vergleichende Cortisoldaten für Störarten im frühen Wachstumsstadium (1 Jahr) vor der Geschlechtsbestimmung liefern.
Protocol
Representative Results
Discussion
Stör wird manchmal als “lebendes Fossil” bezeichnet, weil es in den vergangenen Jahrtausenden nur wenige Anpassungen gezeigt hat. Die Störgattung Acipenser enthält 27 Arten, die Kaviar produzieren; jedoch produzieren drei Arten (Beluga, Baerii und Sevruga) den größten Teil des weltweiten Kaviarangebots. Störe sind anfällig für Überfischung und Einmischung in ihren natürlichen Lebensraum und sind daher stärker gefährdet als jede andere Artengruppe. Störe gehören zur ältesten Gruppe lebender Wirbelt…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde mit Unterstützung des Cooperative Research Program for Agriculture Science & Technology Development (Projekttitel: Tierproduktivitätsänderungsanalyse mit Klimawandel, Projekt Nr. PJ012771), Rural Development Administration, Republik Korea. Auch wurde diese Studie durch ein Stipendium (Nr. PJ01344604) vom Animal Nutrition & Physiology Team, National Institute of Animal Science, RDA, Seoul, Republik Korea. Die Autoren danken dem CEO der persischen Geste Mohammad Hassan Salmanzadeh und seinem Team, das Fische aus den drei in dieser Studie untersuchten Störarten zur Verfügung gestellt hat.
Materials
| Disposal latex surgical gloves | Ansell | 63754090 |
| Platform scale-electronic weighing 100kg | Baskoolnikoo | 101 EM |
| Serological pipette to deliver up to 24 mL | Becton Dickinson Falcon | 35-7550 |
| Micro plate reader with 450 nm and 490 to 492 nm reference filters | BioTek | 8041000 |
| Reagent reservoirs | BrandTech | 703459 |
| Zipper storage plastic bag | Cleanwrap | 30cm x100m |
| Isopropyl alcohol | Daejung chemicals & Metals | 5035-4400 |
| Methyl alcohol | Daejung chemicals & Metals | 5558-4100 |
| Tube rotator- MX-RL-Pro | DLAB Scientific | 824-222217777 |
| Precision pipette to deliver 1.5 and 10 mL | Eppendorf Research Plus | M21518D |
| Precision pipette to deliver 15 and 25 μL | Eppendorf Research Plus | R25623C |
| Weighing paper (107 x 210 mm) | Fisherbrand | 09-898-12B |
| Bead beater, 50/60 Hz 2A | GeneReach Biotechnology Corp | tp0088 |
| Plate rotator with orbit capable of 500 rpm | Hangzhou Miu Instrument | MU-E30-1044 |
| Disposable polypropylene tubes to hold at least 24 mL | Hyundai Micro | H20050 |
| Fume hood | Kwang Dong Industrial | KD 901-22128175 |
| Micro-centrifuge capable of 1500 x g | Labo Gene | 9.900.900.729 |
| Mini vortex mixer | LMS | VTX-3000L |
| Lotte aluminum foil roll | Lotte Aluminum | B0722X5FK5 |
| Digital scale | Mettler Toledo | ME204 |
| Ultrapure water | MDM | MDM-0110 |
| Pipette tips | Neptune Scientific | REF 2100.N |
| Large fish net | Pond H2O | Hoz135 |
| Salivary cortisol kit | Salimetrics | 1-3002-4 |
| Bone cutting forceps | Sankyo | 26-188A |
| Precision multichannel pipette to deliver 50 μL and 200 μL | VITLAB | 18A68756 |
| Towel | Yuhan Kimberly | 1707921546 |
| Tissue paper (107 × 210) | Yuhan Kimberly | 41117 |
References
- Meyer, J. S., Novak, M. A. Hair cortisol: a novel biomarker of hypothalamic-pituitary- adrenocortical activity. Endocrinology. 153, 4120-4127 (2012).
- Ghassemi Nejad, J., et al. A cortisol study: facial hair and nails. Journal of Steroids Hormonal Sciences. 7, 1-5 (2016).
- Meyer, J. S., Novak, M. A., Hamel, A., Rosenberg, K. Extraction and analysis of cortisol from human and monkey hair. Journal of Visualized Experiments. (83), e50882 (2014).
- Davenport, M. D., Tiefenbacher, S., Lutz, C. K., Novak, M. A., Meyer, J. S. Analysis of endogenous cortisol concentrations in the hair of rhesus macaques. General and Comparative Endocrinology. 147, 255-261 (2006).
- Ghassemi Nejad, J., Ataallahi, M., Park, H. K. Methodological validation of measuring Hanwoo hair cortisol concentration using bead beater and surgical scissors. Journal of Animal Science and Technology. 61, 41-46 (2019).
- Ghassemi Nejad, J., et al. Wool cortisol is a better indicator of stress than blood cortisol in ewes exposed to heat stress and water restriction. Animal. 8, 128-132 (2014).
- Brossa, A. C. . Cortisol in skin mucus and scales as a measure of fish stress and habitat quality. Ph.D. dissertation. , (2018).
- Carbajal, A., et al. Cortisol detection in fish scales by enzyme immunoassay: biochemical and methodological validation. Journal of Applied Ichthyology. 34, 1-4 (2018).
- Bertotto, D., et al. Alternative matrices for cortisol measurement in fish. Aquaculture Research. 41, 1261-1267 (2010).
- Ghassemi Nejad, J., Jeong, C., Shahsavarani, H., Sung, I. K., Lee, J. Embedded dental cortisol content: a pilot study. Endocrinology & Metabolic Syndrome. 5, 240 (2016).
- Pankhurst, N. W. The endocrinology of stress in fish: an environmental perspective. General and Comparative Endocrinology. 170, 265-275 (2011).
- Ghassemi Nejad, J., Kim, W. B., Lee, B. H., Sung, K. I. Coat and hair color: hair cortisol and serotonin levels in lactating Holstein cows under heat stress conditions. Animal Science Journal. 88, 190-194 (2017).
- Baker, M. R., Gobush, K. S., Vynne, C. H. Review of factors influencing stress hormones in fish and wildlife. Journal of Nature Conservation. 21, 309-318 (2013).
- Aerts, J., et al. Scales tell a story on the stress history of fish. PLoS One. 10, e0123411 (2015).
- Heimbürge, S., Kanitz, E., Otten, W. The use of hair cortisol for the assessment of stress in animals. General and Comparative Endocrinology. , 10-17 (2019).
- Ghassemi Nejad, J., et al. Comparing hair cortisol concentrations from various body sites and serum cortisol in Holstein lactating cows and heifers during thermal comfort zone. Journal of Veterinary Behavior: Clinical and Application Research. 30, 92-95 (2019).
- Bussy, U., Wassink, L., Scribner, K. T., Li, W. Determination of cortisol in lake sturgeon (Acipenser fulvescens) eggs by liquid chromatography tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography B. 1040, 162-168 (2017).
- SAS. 1999. . SAS. User’s Guide (Version 8.01 Edition). , (1999).
- Barton, B. A. Stress in fishes: a diversity of responses with particular reference to changes in circulating corticosteroids. Integrative and Comparative Biology. 42, 517-525 (2002).
- Ghassemi Nejad, J., et al. Measuring hair and blood cortisol in sheep and dairy cattle using RIA and ELISA assay: a comparison. Biological Rhythm Research. Accepted. , (2019).
