Uso de tejido congelado en el ensayo de cometas para la evaluación del daño causado por el ADN

El ensayo del cometa se utiliza cada vez más como un medio para evaluar el daño del ADN en células cultivadas y tejidos expuestos a productos químicos u otros factores de estrés ambientales¹. El ensayo puede detectar roturas de doble y una sola cadena de ADN, lesiones alcalinas-lábiles y roturas de una sola cadena asociadas con la reparación incompleta del ADN. La directriz del Consejo Internacional para la Armonización de los Requisitos Técnicos de Productos Farmacéuticos de Uso Humano (ICH) para ensayos farmacéuticos recomienda un ensayo de rotura de hebras de ADN, como el ensayo del cometa como una segunda prueba para complementar el ensayo de micronúcleos de eritrocitos para evaluar la genotoxicidad in vivo y como prueba de seguimiento para evaluar el modo de acción en los órganos diana de la inducción tumoral². La Autoridad Europea de Seguridad Alimentaria (EFSA) recomienda el ensayo in vivo del cometa como una prueba de seguimiento adecuada para investigar la pertinencia de un resultado positivo en una prueba de genotoxicidad in vitro³. En 2014, se aprobó una directriz de ensayo de la OCDE para el ensayo de cometas de roedores, aumentando así la aceptabilidad del ensayo para su uso en pruebas reglamentarias del potencial genotóxico. El ensayo se basa en la separación electroforética de bucles de ADN relajados y fragmentos que migran de nucleoides de células lysed. Básicamente, las células individuales están incrustadas en agarosa que se ha en capas en las diapositivas del microscopio. Las diapositivas se sumergen en el tampón de lisis seguido de una solución alcalina (pH > 13), que permite que el ADN nuclear estrechamente enrollado se relaje y se relaje. Las diapositivas se colocan en un campo eléctrico, que estimula la migración del ADN cargado negativamente hacia el ánodo, creando imágenes que se asemejan a los cometas; la cantidad relativa de ADN en la cola del cometa en comparación con la cabeza del cometa es directamente proporcional a la cantidad de daño del ADN; El contenido de ADN en la cola se cuantifica típicamente mediante un software de imágenes digitales.

Debido a que el ensayo del cometa detecta ADN fragmentado, la cuantificación precisa del daño del ADN inducido por la exposición puede confundirse por la fragmentación de la cromatina asociada con la necrosis o la apoptosis resultante de la citotoxicidad o el estrés inducidos por el tratamiento. Además, el daño del ADN puede ocurrir como resultado de un cizallamiento mecánico o un procesamiento inadecuado de muestras^4. La importancia de mantener el tejido cosechado refrigerado antes de la preparación de la diapositiva para minimizar el nivel basal de daño en el ADN se ha demostrado previamente^5,6. Muchos laboratorios preparan diapositivas de ensayo de cometas a partir de tejido fresco; sin embargo, esto puede ser logísticamente difícil al preparar diapositivas de múltiples tipos de tejidos por animal en un estudio con un gran número de animales. Además, esto presenta un problema cuando la preparación y el análisis de diapositivas se producen en un laboratorio remoto, lo que requiere el envío de muestras. Por ejemplo, el Programa Nacional de Toxicología de los Estados Unidos incluye el ensayo del cometa como un componente de su programa de pruebas de toxicología genética (https://ntp.niehs.nih.gov/testing/types/genetic/index.html) y a veces incorpora el ensayo en estudios de toxicidad por dosis repetidas de 28 o 90 días; esto requiere la recolección de tejido por el laboratorio en la vida y la transferencia de muestras a otro laboratorio para su análisis. Para lograr esto, las piezas de tejido se pican, y / o células epiteliales del tracto gastrointestinal se raspan y las suspensiones celulares se congelan y se almacenan en un congelador para su posterior envío y almacenamiento por el laboratorio receptor hasta el análisis⁷. El manejo adecuado de las muestras es crucial para obtener datos de alta calidad utilizando tejido congelado; sin embargo, la manipulación reproducible de muestras de tejidos durante las necropsias realizadas por personal en constante cambio es difícil de controlar, especialmente en laboratorios de la vida que no cosechan rutinariamente tejidos para el ensayo del cometa. La capacitación más actualizada del personal de necropsia o el uso de una unidad móvil atendida por personal de laboratorio experimentado para recoger muestras de tejido fresco o congelado es a menudo demasiado costosa, no factible, o simplemente infravalorada.

Para asegurar mejor la generación constante de muestras de tejido de alta calidad para su transferencia a un sitio remoto para el análisis de ensayos de cometas, se exploró la utilidad de un método publicado⁶ de preservación de tejidos a partir de cubos de tejido congelados. En este método, los cubos congelados de tejido se cargan en un dispositivo de picado de tejido de acero inoxidable(Figura 1) que se coloca en un tubo de microcentrífuga que contiene tampón frío. El cubo de tejido se empuja a través de una pequeña malla de calibre al final del dispositivo. Forzando repetidamente la suspensión de tejido a través del tamiz de malla en ambas direcciones varias veces resulta en una suspensión de una sola célula relativamente uniforme. Las muestras preparadas por este método se compararon favorablemente en calidad con muestras de tejido fresco y congelado preparadas por picado. Como beneficio adicional, a diferencia de las muestras picadas, los cubos de tejido se pueden almacenar congelados durante períodos prolongados de tiempo y todavía producen resultados de alta calidad en el ensayo del cometa.