Использование замороженных тканей в ассе кометы для оценки повреждения ДНК

Анализ кометы все чаще используется в качестве средства оценки повреждения ДНК в культивированных клетках и тканях, подвергающихся воздействию химических веществ или других экологических стрессоров^1. Анализ может обнаружить ДНК двух- и однострочных разрывов, щелочных лабильных поражений, и однострочные перерывы, связанные с неполным ремонтом ДНК. Международный совет по гармонизации технических требований к фармацевтическим препаратам для использования человека (ICH) руководство для фармацевтического тестирования рекомендует ДНК нити асссе, такие как анализ кометы в качестве второго теста в дополнение к грызунов эритроцита микронуклета анализа для оценки виво генотоксичности и в качестве последующего теста для оценки режима действия в целевых органов опухоли^{опухоли 2}. Европейское управление по безопасности пищевых продуктов (EFSA) рекомендует анализ кометы in vivo в качестве подходящего последующего теста для исследования актуальности положительного результата в тесте по генококсикности in vitro^3. В 2014 году было утверждено руководство ОЭСР по тестированию кометы грызунов, что увеличило приемлемость анализа для использования в регулятивном тестировании генотоксического потенциала. Анализ основан на электрофоретической разделении расслабленных циклов ДНК и фрагментов, которые мигрируют из нуклеоидов лизированных клеток. В основном, одиночные клетки встроены в агарозу, которая была слоистых на микроскоп слайды. Слайды затем погружаются в буфер лизиса, а затем щелочной (pH ) решение, которое позволяет плотно смоченной ядерной ДНК, чтобы расслабиться и расслабиться. Слайды затем помещаются в электрическое поле, которое стимулирует миграцию отрицательно заряженной ДНК к аноду, создавая изображения, напоминающие кометы; относительное количество ДНК в хвосте кометы по сравнению с головкой кометы прямо пропорционально количеству повреждений ДНК; Содержание ДНК в хвосте, как правило, количественно с помощью цифрового программного обеспечения изображений.

Поскольку анализ кометы обнаруживает фрагментированную ДНК, точная количественная количественная оценка повреждения ДНК, вызванного воздействием, может быть сбита с толку фрагментацией хроматина, связанной с некрозом или апоптозом в результате вызванной лечением цитотоксичности или стресса. Кроме того, повреждение ДНК может произойти в результате механической стрижки или неправильной обработки образцов^4. Важность поддержания собранной ткани охлажденной до слайд-подготовки, чтобы свести к минимуму базовый уровень повреждения ДНК, ранее было продемонстрировано^5,,6. Многие лаборатории готовят кометные асссивы слайдов из свежей ткани; однако, это может быть логистически сложной при подготовке слайдов из нескольких типов тканей на животное в исследовании с большим количеством животных. Кроме того, это создает проблему, когда подготовка и анализ слайдов должны происходить в удаленной лаборатории, что требует отгрузки образцов. Например, Национальная программа токсикологии США включает анализ кометы в качестве компонента своей программы тестирования на генетическую токсикологию (https://ntp.niehs.nih.gov/testing/types/genetic/index.html), а иногда включает анализ в 28 или 90 дней повторных исследований токсичности дозы; это требует сбора тканей лабораторией в течение всей жизни и передачи образцов в другую лабораторию для анализа. Для достижения этой цели, части ткани измельчаются, и / или эпителиальных клеток желудочно-кишечного тракта Царапины и клеточной суспензии флэш-заморожены и хранятся в морозильной камере для последующей отгрузки и хранения в приемной лаборатории до анализа⁷. Правильная обработка образцов имеет решающее значение для получения высококачественных данных с использованием замороженных тканей; однако, воспроизводимые манипуляции образцов тканей во время некропсии, выполняемые постоянно меняющимся персоналом, трудно контролировать, особенно в лабораториях в жизни, которые обычно не собирают ткани для анализа кометы. Освежающее обучение персонала по некропсии или использование мобильного подразделения, укомплектованного опытным лабораторным персоналом для сбора образцов свежих или замороженных тканей, зачастую является слишком дорогостоящим, неосуществимым или просто недооцененным.

Для лучшего обеспечения последовательного генерации высококачественных образцов тканей для переноса в удаленный участок для анализа анализа кометы была изучена полезность опубликованного метода⁶ сохранения тканей из флэш-замороженных кубов ткани. В этом методе замороженные кубики ткани загружаются в устройство для измельчения тканей из нержавеющей стали(рисунок 1), которое помещается в микроцентрифугную трубку, содержащую холодный буфер. Куб ткани затем проталкивается через небольшую калибровочная сетка в конце устройства. Неоднократное принуждение ткани суспензии через сеточное сито в обоих направлениях несколько раз приводит к относительно равномерной одноклеточной суспензии. Образцы, подготовленные этим методом, по качеству сравнивали как со свежими, так и с замороженными образцами тканей, подготовленными путем измельчения. В качестве дополнительного преимущества, в отличие от фарша, кубики тканей могут храниться замороженными в течение длительных периодов времени и по-прежнему дают высокие результаты качества в анализе кометы.