שימוש ברקמות קפואות בתוך שיטת שביט להערכת נזק לדנ א

שיטת השביט משמשת יותר ויותר כאמצעי להערכת נזקי DNA בתאים מתורבתים ורקמות חשופים לכימיקלים או לחצים סביבתיים אחרים¹. האפשרות הניתנת לזיהוי הפסקות דנ א כפולות ויחיד, נגעים אלקלי-לבנה, ומעברי-גדיל בודדים הקשורים לתיקון DNA לא שלם. המועצה הבינלאומית להרמוניה של דרישות טכניות עבור תרופות לשימוש האדם (העליונה) מנחה עבור בדיקות התרופות ממליץ על הצירוף DNA שבירה כגון שיטת השביט כמבחן השני כדי להשלים את הטיפול מכרסם מיקרוקליאוס מיקרו להערכת vivo גנורעילות וכמבחן מעקב להערכת מצב של פעולה באברי היעד^{של אינדוקציה גידול} הרשות האירופית לבטיחות מזון (EFSA) ממליצה על שיטת שביט vivo כמבחן המשך המעקב המתאים לחקירת הרלוונטיות של תוצאה חיובית במבחן הרעילות של מבחנה³. ב-2014 אושרה מבחן ה-OECD לצורך הבחינה של כוכב השביט המכרסמים, ובכך הגבירה את יכולת ההתמדה לשימוש בבדיקות רגולטוריות של פוטנציאל הגנוטוקסיס. המנה מבוססת על הפרדה אלקטרופיניטית של לולאות DNA רגוע ושברי העוברים מתוך נוקלאונואידים של תאים ליטיים. ביסודו של דבר, תאים בודדים מוטבעים agarose כי כבר שכבתית על שקופיות מיקרוסקופ. שקופיות לאחר מכן שקוע במאגר הליזה ואחריו בסיסי (pH > 13) פתרון, אשר מאפשר את ה-DNA הגרעינית היטב מתפתל להירגע ולהירגע. שקופיות ממוקמות לאחר מכן בשדה חשמלי, אשר מעורר הגירה של דנ א טעונה שלילית לקראת האנדה, יצירת תמונות הדומות לשביט; הכמות היחסית של ה-DNA בזנב השביט בהשוואה לראש כוכב השביט הוא פרופורציונלי באופן ישיר כמות של נזק DNA; תוכן ה-DNA בזנב הוא בדרך כלל בכמת באמצעות תוכנת דימות דיגיטלי.

בגלל שיטת השביט מזהה דנ א מפוצל, כימות מדויק של הנזק לחשיפה DNA המושרה יכול להיות מבולבל על ידי פיצול כרומטין הקשורים נמק או אפופטוזיס הנובע הטיפול המושרה ציטוזה או מתח. יתר על כן, נזק DNA יכול להתרחש כתוצאה של הטיה מכני או עיבוד לדוגמה לא תקין⁴. החשיבות של שמירה על רקמות שנקטפו מקורר לפני הכנת שקופית כדי למזער את רמת בסיסית של נזק DNA הפגינו בעבר^5,6. מעבדות רבות מכינות שביט מתוך רקמה טרייה; עם זאת, הדבר יכול להיות מאתגר לוגיאני כאשר מכינים שקופיות מסוגי רקמות מרובים לכל בעל חיים במחקר עם מספר רב של בעלי חיים. כמו-כן, מדובר בבעיה כאשר ההכנה והניתוח של השקופיות מתרחשות במעבדה מרוחקת, הדורשת משלוח של דגימות. לדוגמה, תוכנית הטוקסיקולוגיה הלאומית של ארצות הברית כוללת את שיטת השביט כרכיב של תוכנית הרעלים הגנטית שלה בדיקה (https://ntp.niehs.nih.gov/testing/types/genetic/index.html) ולפעמים משלבת את הערך לתוך 28 או 90 יום לימודי הרעילות במינון; זה מחייבת אוסף של רקמות על ידי המעבדה בחיים והעברת דגימות למעבדה אחרת לניתוח. כדי להשיג את זה, חתיכות רקמה הם כתוש, ו/או תאים אפיתל של מערכת העיכול הם מגורד ושתלים סלולריים הם פלאש קפואים ומאוחסנים במקפיא עבור המשלוח הבאים ואחסון על ידי המעבדה המקבלת עד ניתוח⁷. טיפול נאות של דגימות חיוני להשגת נתונים באיכות גבוהה באמצעות רקמה קפואה; עם זאת, מניפולציה בלתי משתנה של דגימות רקמה במהלך נקרוזים שבוצעו על ידי אנשים שמשתנים אי פעם קשה לשלוט, במיוחד במעבדות בחיים כי לא באופן שגרתי הקציר רקמות עבור שביט השביט. רענון האימון של צוות נמק או שימוש ביחידה ניידת מאויש על ידי אנשי מעבדה מנוסים כדי לאסוף דגימות רקמות טריות או קפואות הוא לעתים קרובות יקר מדי, לא ריאלי, או פשוט חסר ערך.

כדי להבטיח בצורה טובה יותר את הדור העקבי של דגימות רקמה באיכות גבוהה עבור העברה לאתר מרוחק עבור ניתוח שביט כוכב, השירות של שיטה שפורסמה⁶ של שימור רקמות מפני קוביות פלאש קפוא של רקמות נחקרו. בשיטה זו, קוביות קפוא של רקמות נטענים לתוך מכשיר מיקרו של רקמת נירוסטה (איור 1) הממוקם לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה המכיל מאגר קר. הקוביה של רקמות הוא דחף לאחר מכן דרך מד קטן שינוי בסוף המכשיר. שוב ושוב השעיית רקמות דרך מסננת שינוי בשני הכיוונים מספר פעמים גורמת השעיית תא אחיד בודד יחסית. דגימות שהוכנו על ידי שיטה זו בהשוואה לטובה באיכות לדגימות רקמות טריות וקפואות שהוכנו על ידי מינויה. כתוספת תועלת, בניגוד דגימות בשר טחון, קוביות רקמה ניתן לאחסן קפוא לפרקי זמן ממושך ועדיין להניב תוצאות באיכות גבוהה בתוך שביט השביט.