在彗星分析中使用冷冻组织评估DNA损伤
Summary
该协议描述了在尸体解剖时准备高质量冷冻组织样本以评估DNA损伤的几个程序：1） 切碎组织，2） 从胃肠道刮掉上皮细胞，3） 块状组织样品，需要使用组织切碎装置进行均质化。
Abstract
彗星测定越来越受欢迎，作为评估培养细胞和组织DNA损伤的一种手段，特别是在接触化学物质或其他环境压力因素之后。2014年通过了经济合作与发展组织（OECD）测试指南，推动了彗星检测在啮齿动物基因毒性可能性监管测试中的使用。彗星测定幻灯片通常是在尸体解剖时从新鲜组织制备的;然而，冷冻组织样本可以避免与同时制备每只动物和许多动物的幻灯片相关的后勤挑战。冷冻还允许将样品从暴露设施运送到不同的实验室进行分析，而冷冻组织的储存有助于推迟为特定器官生成DNA损伤数据的决定。碱性彗星测定可用于检测与暴露相关的DNA双绞线和单链断裂、碱性拉片病变以及与不完全DNA切除修复相关的绞线断裂。然而，DNA损伤也可能由机械剪切或不当的样品处理程序造成，混淆了测定结果。由于实验室人员在为彗星测定采集组织方面具有不同程度的经验，因此在尸体解剖期间收集和处理组织样本的可重复性可能难以控制。通过进修培训或部署配备经验丰富的实验室人员的机动单位来增强一致性成本高昂，而且可能并不总是可行的。为了优化彗星检测分析的高质量样品的一致生成，评估了一种使用定制组织切碎装置对闪冻结组织块进行均质化的方法。用这种方法为彗星检测准备的样品在质量上与在尸检期间切碎制备的新鲜和冷冻组织样本相比，质量优视。此外，在长期储存后，从冷冻组织立方体的细胞中测量低基线DNA损伤。
Introduction
彗星测定越来越多地被用作评估受培养细胞和组织DNA损伤的手段，这些细胞和组织暴露于化学物质或其他环境压力因素1。该测定可以检测DNA双绞线和单链断裂、碱性病变和与不完全DNA修复相关的单股断裂。国际药物药物技术要求协调委员会（ICH）药物测试指南建议DNA链断裂测定，如彗星测定作为第二次测试，以补充啮齿动物红细胞微核测定，以评估体内基因毒性，并作为后续测试，以评估肿瘤诱导2的目标器官的作用模式。欧洲食品安全局（EFSA）建议体内彗星测定作为一个合适的后续测试，以调查体外基因毒性试验3阳性结果的相关性。2014年，经合组织批准了啮齿动物彗星测定测试指南，从而提高了该测定在基因毒性电位监管测试中的可接受性。该测定基于从裂解细胞的细胞核素迁移的放松DNA回路和片段的电泳分离。基本上，单个细胞嵌入在阿加罗斯中，这种细胞被分层到显微镜幻灯片上。然后，幻灯片浸入滑管中，然后浸入碱性 （pH > 13） 溶液中，使紧密卷曲的核 DNA 放松和放松。然后，幻灯片被放置在电场中，刺激带负电荷的DNA向阳极迁移，产生类似于彗星的图像;彗尾与彗星头的相对DNA量与DNA损伤量成正比;尾部的DNA含量通常使用数字成像软件进行量化。
由于彗星测定检测成碎片DNA，因此，由治疗引起的细胞毒性或应力引起的染色质分裂或凋亡可能混淆暴露引起的DNA损伤。此外，DNA损伤可能由于机械剪切或不当的样品处理4。在幻灯片准备之前保持收获的组织冷藏的重要性，以尽量减少DNA损伤的基线水平，此前已经证明55，6。6许多实验室准备来自新鲜组织的彗星测定幻灯片;然而，在与大量动物的研究中，在准备每只动物的多种组织类型的幻灯片时，这在后勤上可能具有挑战性。此外，当在远程实验室进行幻灯片准备和分析时，这就提出了一个问题，需要装运样品。例如，美国国家毒理学计划将彗星测定作为其遗传毒理学测试计划（https://ntp.niehs.nih.gov/testing/types/genetic/index.html）的组成部分，有时还将该测定纳入28天或90天的重复剂量毒性研究;这需要由生命实验室收集组织，并将样品转移到另一个实验室进行分析。为此，将组织碎片切碎，和/或胃肠道上皮细胞被刮伤，细胞悬浮液被闪入冷冻并储存在冰柜中，供接收实验室随后装运和储存，直到分析7。正确处理样品对于使用冷冻组织获取高质量数据至关重要;然而，在不断变化的人员进行的尸检期间对组织样本的可重复操作是难以控制的，尤其是在不定期为彗星检测采集组织的生命实验室。对尸检人员进行进修培训或使用由经验丰富的实验室人员组成的流动单位收集新鲜或冷冻组织样本往往成本太高、不可行或被简单地低估。
为了更好地确保高质量组织样本的一致生成，以便转移到远程地点进行彗星检测分析，探讨了已公布的从闪冻组织立方体保存组织的方法6的效用。在这种方法中，冷冻的组织立方体被装入不锈钢组织切碎装置（图1），该装置被放入含有冷缓冲液的微离心管中。然后，组织立方体通过设备末端的小仪表网格推。多次通过两个方向的网状筛子反复强迫组织悬浮液，导致相对均匀的单细胞悬浮液。该方法制备的样品在质量上与通过切碎制备的新鲜和冷冻组织样本相比，具有优优。作为一个额外的好处，与切碎的样品不同，组织立方体可以长期冷冻储存，在彗星测定中仍然产生高质量的结果。
Protocol
Representative Results
Discussion
如前77、12、1312,13所示，妥善处理的闪速冷冻碎组织在彗星测定中提供了良好的效果。事实上，根据经合组织测试指南9建议的新鲜切碎大鼠肝脏样本，我们实验室准备的冷冻碎鼠和小鼠肝脏的基线%尾部DNA值通常为±6%。多个实验室利用各种被切碎和冷冻储存的组织类型取得了良好的结果;同样，从胃肠道器官刮…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
作者感谢林肯·马丁和凯利·欧文斯为准备彗星幻灯片和给彗星幻灯片打分的专家技术援助，感谢卡罗尔·斯瓦茨博士进行统计分析。作者还感谢ILS遗传毒理学、调查毒理学和作物学项目的成员的支持性贡献。
Materials
| Cryovials | Corning Costar | 430488 | |
| Dental Wax Sheets | Electron Microscopy Sciences | 72670 | |
| Dissecting (Mincing) Micro Scissors | Fisher Scientific | 08-953-1B | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Hank's Balanced Salt Solution | Gibco | 14175-079 | |
| KCl | Teknova | P0315-10 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P9791 | |
| Low Melting Point Agarose | Lonza | 50081 | |
| Microfuge Tubes (1.7 mL ) | Corning | 3207 | |
| Na2EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S7907 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S6191 | |
| Neutral Buffered Formalin | Leica | 600 | |
| Scalpel Blades | Miltex | 4-110 | |
| Syringe Plunger (1 mL ) | Fisher Scientific or Vitality Medical | 14-826-88; 8881901014 | Becton Dickinson or Monoject tuberculin syringe |
| Tissue Mincing Device | NorGenoTech (Oslo, Norway) | None | Small variability in diameter observed which can affect snuggness of plunger. |
| Tweezers, plastic | Trade Winds Direct | DF8088N | Reinforced nylon, nonsterile, blunt tip, autoclavable; tradewindsdirect.com |
| Weigh Boats | Krackler Scientific/Heathrow Scientific | 6290-14251B |
References
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