管状構造の組織工学のためのコア/シェル印刷足場

この研究の目的は、木質杭構造のコア/シェル印刷用のルアー互換性を持つ、製造しやすいコア/シェルノズルを開発することです。さらに、簡単で反復可能なワンステップ印刷プロトコルが説明され、幅広い材料と異なる化学架橋機構を簡単に変更でき、明確に定義され、説得力のある足場を構築します。血管および他の管状組織構造の工学。 コア/シェルノズルノズルは、G27の鈍い端針(内側の軸フィラメントを印刷するための)とノズル本体で構成され、針を所定の位置に保持し、材料入力用の接続ポートを備えたシェルフィラメントの外側ノズルを作成します。図 1 に回路図を示します。個々の押出機に置かれ、コアおよび貝材料を提供する2つの5 mLの注射器。チューブはノズル本体をシリンジと接続し、シェル材料を提供します。 コア/シェルノズルとシリンジのセットアップの完全なアセンブリを図 2 に示します。ノズル本体の最初の機能プロトタイプは、ポリオキシメチレン(POM)のブロックを粉砕するCNCによって製造された。要素間の互換性とシールは、G27針とチューブをVitaprintに取り付けることによって試験した。ノズル、ルアーロックコネクタ、または本体と針の間にシェル材料の漏れは認められませんでした。ノズル本体は針ハブ(luerコネクタ)としっかりとフィットし、ノズル全体の動きを押出機と同期させます。 足場の建物足場を作製する最も簡単なアプローチは、印刷方向が連続する層ごとに変更される層によって材料層を堆積させ、通常は90°の角度で配置することです。ヒドロゲルの粘弾性および吸湿特性のために、印刷された構造の形状の忠実度を保持することは挑戦的なままである。このプロトコルセクションの主な目的は、2つのポリマーを使用したパーフューズブルコア/シェル足場の3Dプリンティングであり、以前に増加したセルロースナノファイバー(NFC)を添加した足場の建物(ALGおよびCMC)に有望な結果を示しました。機械的安定性。ALGおよびCMCはいずれも負に帯電し、水溶性線形共重合体48と共重であり、いずれもカルボキシル基を含有し、これは二体陽イオンの添加と架橋することができる。Ca2+粒子は、2つの官能基を同時に有するイオン結合を形成し、ポリマー鎖間の接続を形成し、ゲル剛性を高める。 パーフューズ可能な足場の印刷このプロセスの目的は、複数の層にまたがるシンプルな木の杭足場構造を3Dプリントし、完全に架橋されるまでその形状の忠実性と説得力を維持することです。これには、クロスオーバーやリトラクションの動きのないコアとシェルの共押しも必要で、フローを中断する可能性があります。したがって、一般的な CAD モデリングおよびスライス方法はあまり適していません。この研究では、手動で設計されたgコードを使用し、高速gコード準備のためにPythonベースのgコードジェネレータを開発しました。 足場は木の木の格子形で構成され、平らなガラス表面の上に造られた。製作は層ごとに行い、後続層の交差線を前のものに対して90°の角度で堆積した。さらに、後続層はX方向とY方向で2%狭く、先行層による連続フィラメント支持を確保した。フィラメント間の距離(マクロポアサイズ)は、押し出されたフィラメントの外径(0.8mm)とグリッド線間の距離(3mm)を考慮してgコードで正確に設計することができます。 足場は、さらなる検討のための主要な包含基準を満たすために必要とされました。第一に、高さが少なくとも4層の足場は、印刷中に構造的完全性と形状(例えば、マクロポアサイズ)を保持し、さらなる開発の対象となる必要がありました。第二に、足場は37°Cで細胞培養培養剤で7日間インキュベートされた後も、耐噴性(安定なマイクロチャネル)を維持する必要がありました。適切な時間間隔(1、2、5、および7日)で、足場を培養培養物から取り出し、それらがまだ説得可能であるかどうかを調べた。図4Aでは、新たに印刷および後処理された足場の断面は、フィラメント内部に明確に見える中空チャネルを表示する。図4Bでは、37°Cの細胞培養培養培養物中72時間インキュベーション後も、フィラメントが足場全体の長さを通して中空構造を保持していることは明らかである。 いくつかの製剤は、印刷可能であり、構造的に安定したまま、印刷された幾何学を維持し、説得可能なままでした。しかし、さらなる試験(すなわち、3重量%ALG + 3 wt.% CMC + 1.5 wt.% NFC)のために単一の1つが選択され、最大10層のパーフューズ可能な足場の印刷が可能でした。カスタム ノズルを使用した印刷プロセスを図 5Aに示します。コア/シェル印刷は、より少ない粘性製剤で可能でした。しかし、より高い濃度のゲルはノズルを通る連続的な流れを可能にしなかった。一次架橋(コア材料、印刷中に送達される)については、100mMCaCl2が利用され、ノズル内のゲル固化を引き起こすことなく、中空フィラメントの連続形成を十分に安定化させた。ポスト印刷後、足場を5重量Cl2溶液に浸し、ヒドロゲルを完全に架け、長期的な形状忠実性を求めた。完成した足場のサンプルを図 5Bに示します。最適化の間、人工色素の製剤のプロセスは、コア溶液に使用され、視覚的な評価を可能にし、押し出されたフィラメントの品質を調べるようにした。染料は、細胞の播種および栽培のために調製された最終足場の製造に使用されなかった。 ライブ/デッドアッセイインキュベーション後、生きた/死んだアッセイを使用して、ICを可視化し、インキュベートされた足場内の生きている(緑色)細胞と死んだ(赤)細胞を区別しました。これは、2つの主な目的を果たした:A)足場が細胞に有害な影響を示さずに成長と接着を促進する生体適合性環境を提供するかどうかを決定し、B)管状構造およびその構造の構造的完全性を可視化する。内部チャネル システムの詳細を説明します。 生きた/死んだアッセイの結果を図6に示します。細胞内エステラーゼの存在下で、血漿膜透過性カルセイン-AMはカルセインに変換され、生細胞中の緑色蛍光光を放出する。一方、アポトーシス細胞は、膜不透過性プロピジウムヨウ化物によって可視化され、DNA二重らせんにインターカレーゼーションすると赤色で蛍石が生えます。生きている/死んだイメージおよび足場の明るい分野の写真は中空チャネルの中の細胞を視覚化するのを助けるために結合された。染色液を注入し、48時間足場細胞インキュベーション後に3Dプリント足場で直接行ったアッセイを行った。 この研究は、パーフューズ可能な足場のコア/シェル印刷の概念実証としてのみ役立つため、比較的小さなシード密度のIC(340,000セル/mL)が使用されたことに留意すべきである。生きた/死んだアッセイの最も重要な結論は、48時間後でさえ死んだ細胞(赤色)が観察されず、足場材料自体もその分解産物も毒性効果を示さなかったことを証明した。さらに、ICは実際に付着し、足場の中に付着したままで、チャネル内で成長すると均一に分散凝集体を形成するように見えました。これは、記載された製造方法および足場製剤が、生体内での構築に適したフレームワークを提供することを示唆している。複雑な組織工学は、3つの空間的な次元すべてで細胞とECMの相互作用とタイトな細胞間関を模倣することに加えて、その生存率を維持するために新鮮な培地への一定の細胞暴露を必要とします。これは、連続灌流の下で密なチャネルネットワークによって達成することができ、これは将来の仕事でさらなる調査を保証し、血管系の長期的な組織工学を容易にするために材料および成長変数を最適化する必要がある。 図1:コア/シェルノズルプロトタイプ。(A)ノズル本体プロトタイプの全体的な設計と主なコンポーネントを示します。ノズルは上部を通して鈍い端のG27の針を挿入することによって完了する。上部および下部の針のホルダーは、針を固定し、ノズル軸と再調整し、先端がノズルから中心まで伸びていることを保証する。 ノズルを二次注射器から押し出された「シェル」材料で接続するには、luerロックコネクタを備えたチューブを横入力に取り付けます。ここから、材料は狭いチャネルを通してノズルに転送される。上記のチャネルの製造には、製造後にキャップする必要がある穴を2つの位置で掘削する必要があります)。(B)図示は、挿入されたG27針を持つノズルのクローズアップであり、ノズルから伸びる。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 図 2: 最終的なコア/シェルのセットアップ。(A)示すのは、ヒドロゲル(右)を含む正しく取り付けられたシリンジを備えた完成したコア/シェルノズルで、「シェル」と架橋液(左)を「コア」として押し出したものです。(B) 2つの押出機を備えたVitaprintシステムに取り付けられたコア/シェルのセットアップを示します。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 図3:管状足場のGコード。ここでは、プリンタソフトウェアのスクリーンショット、具体的にはパスプレビュー(A)と第1層の生のgコード(B)が表示されます。g コードは、絶対空間方向 (X、Y、Z) のターゲット座標と、相対方向の押し出し (A,B) を持つ一連の命令です。G コマンドは命令のタイプを決定しますが、G1 はターゲット座標に向かって線形移動を表し、G92 は最初の開始位置を決定します。また、以下のコマンドの送り速度は、指示Fをmm/minで決定します。 図4:中空の内部を持つ足場鎖の断面。(A)表示されているのは、新しく印刷され、後処理された足場の断面スライスです。(B)図示は、72時間の細胞培養培養培養培養物でインキュベートされた後の足場の断面スライスである。ノズル形状は、円形の断面を持つチューブの押し出しを定義しますが、フィラメントは堆積時に幾分平坦化されているように見えます。しかし、内部チャネルはそのまま残り、インキュベーション中にその形態を保持します。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 図 5: 足場のコア/シェル印刷。ここで、3層中空管足場及びその最終形態(B)の製造(A)を示す。改善された可視化のために、コア内の架橋溶液を赤色染料で染色した。製剤は足場の安定性を保持するのに十分な機械的安定性を示し、たとえより厚い構造(最大10層、図示されていないデータ)が製造された場合であっても。最終構造の外形寸法は約27mm×27mm×3.5mm。 図6:足場で直接行われる生きた/死んだアッセイ。HUVECの懸濁液を内側の足場チャネルに注入し、48時間インキュベートし、生/死色素で処理した。生存可能なHUVECは、画像の明るいスポットで表される緑色蛍光灯を放出する。死細胞は緑色蛍光灯を発する。ただし、観測された足場には何も表示されません。細胞の分布はまた、チャネルの形状および保持灌流能力を意味する。わずかな程度に、生きている/死んだアッセイ溶液はまた足場材料を染色し、顕微鏡下で光蛍光を作り出した。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。