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Bio-ingénierie

Scaffold di stampa Core/shell per l'ingegneria dei tessuti di strutture tubolari

Published: September 27, 2019
doi:
10.3791/59951
, , , , , ,
1Institute of Biomedical Sciences, Faculty of Medicine,University of Maribor, 2Institute for Development of Advanced Applied Systems (IRNAS), 3Department of Pharmacology, Faculty of Medicine,University of Maribor

Summary

Presentato qui è un set-up biostampa tridimensionale semplice da usare, nucleo/guscio, tridimensionale per la fabbricazione in un solo passaggio di scaffold cavi, adatto per l’ingegneria tissutale di strutture vascolari e altre strutture tubolari.

Abstract

La stampa tridimensionale (3D) di filamenti core/shell consente la fabbricazione diretta di strutture di canale con un guscio stabile che è cross-linked all’interfaccia con un nucleo liquido. Quest’ultimo viene rimosso dopo la stampa, lasciando dietro di sé un tubo cavo. L’integrazione di una tecnica di produzione additiva (come quella qui descritta con inchiostri [bio] su misura, che imitano strutturalmente e biochimicamente la matrice extracellulare nativa [ECM]) è un passo importante verso l’ingegneria avanzata dei tessuti. Tuttavia, la fabbricazione precisa di strutture ben definite richiede strategie di fabbricazione personalizzate ottimizzate per il materiale in uso. Pertanto, è ragionevole iniziare con un set-up che è personalizzabile, semplice da usare e compatibile con un ampio spettro di materiali e applicazioni. Questo lavoro presenta un ugello core/shell facile da produrre con compatibilità luer per esplorare la stampa core/shell di strutture in legno, testata con una formulazione di materiale scaffold ben definita a base algerata.

Introduction

Probabilmente, l’obiettivo finale dell’ingegneria tissutale (TE) è quello di produrre tessuti funzionali o organi in vitro, che possono essere utilizzati per rigenerare o sostituire parti ferite o malate del corpo umano1,2,3. L’attuale ricerca in ingegneria tissutale (TE) si concentra su singoli aspetti del settore (materiali di costruzione, procedure di fabbricazione, fonti cellulari, ecc.) 4,5, oltre a sviluppare semplici modelli in vitro di tessuti e organi che imitano gli aspetti fondamentali delle loro controparti in vivo. Tali modelli sono già utili per molte applicazioni, come lo screening farmacologico e gli studi di tossicità, soprattutto nei casi in cui le colture cellulari convenzionali 2D non riescono a imitare le risposte dinamiche dei tessuti nativi6,7, 8,9. I modelli tridimensionali in vitro sono di solito costruiti combinando le celle10, cue fisico-chimiche11e molecole biologicamente attive12,13 su scaffold, che si ottengono da tessuti decellularizzati o costruiti de novo da materiali biologici o biocompatibili14,15,16,17,18.

È fondamentale che gli scaffold riformulininininino la complessa microarchitettura 3D e la struttura gerarchica dei tessuti nativi per consentire la funzionalità dei tessuti ingegnerizzati, rappresentativi dei tessuti in vivo19. Nonostante il significativo progresso tecnologico in TE, lo sviluppo di costrutti di tessuto artificiale fisiologicamente rilevanti rimane una sfida. I tessuti spessi (>200 m di spessore) sono particolarmente problematici, a causa di limitazioni come l’ossigeno e la diffusione dei nutrienti20. Sono stati compiuti progressi verso costrutti di tessuto più grandi; tuttavia, l’elevata vicinanza necessaria delle cellule ai vasi sanguigni al fine di trasportare ossigeno e sostanze nutritive e promuovere la rimozione dei rifiuti deve essere riassunta. La vascolarizzazione dei tessuti (o in alternativa, la fabbricazione di reti vascolari 3D interconnesse all’interno di costrutti di tessuto) svolge un ruolo fondamentale nel mantenimento della vitalità cellulare e nella promozione delle funzioni dei tessuti in vitro, il che è più difficile per modelli in esperimenti prolungati21,22. Inoltre, la risoluzione, l’integrità strutturale e la biocompatibilità simultanee devono ancora essere raggiunte23.

Diversi approcci TE sono stati proposti nel tentativo di costruire strutture simili ai vasi sanguigni e facilitare la vascolarizzazione in vitro. Alcuni esempi includono la semina di cellule endotemili (anche co-coltivate con altri tipi di cellule come i fibroblasti) che si auto-assemblano per generare reti microvascolari24, l’uso di cellule progenitrici vascolari e periciti che promuovono le cellule endoteliali crescita21,25, la fornitura di fattori di crescita angiogenici che inducono la vascolarizzazione20,26, utilizzando la tecnologia lamiera cellulare che consente il controllo sulla stratificazione vascolare20, e la fabbricazione di strutture di scaffold altamente porosi che promuovono l’angiogenesi27. Gli approcci menzionati si concentrano sull’induzione dell’angiogenesi, che generalmente richiede notevoli quantità di fattori di crescita aggiuntivi (ad esempio, VEGF) e tempo per formarsi. Tuttavia, i più grandi inconvenienti sono la loro limitata riproducibilità e il controllo spaziale limitato sul patterning vascolare, di solito con conseguente distribuzione casuale della vascolatura all’interno del costrutto del tessuto che non facilita necessariamente la perfusione.

La produzione additiva (AM, come la biostampa 3D) è sempre più coinvolta nella fabbricazione di costrutti 3D utilizzando materiali biologici o biocompatibili per creare scaffold adatti a TE. Diversi approcci AM vengono utilizzati e sviluppati in parallelo (ad esempio, metodi basati su getto d’inchiostro e microestrusione, diversi tipi di tecniche litografiche) per produrre scaffold che imitano tessuti nativi nella loro architettura, biochimica e funzionalità . Le singole tecniche presentano alcuni vantaggi e svantaggi28, motivo per cui varie modifiche in fase di esplorazione (ad esempio, micro-patterning, angiogenesi indotta, ecc.) per aumentare la misura in cui vascolare grande, complesso e stabile possono essere fabbricati22,29,30.

Tra questi, la biostampa dell’estrusione è il metodo più comunemente usato, soprattutto a causa dell’ampia gamma di materiali compatibili (un processo generalmente rispettoso delle cellule28,31,32) e l’eccezionale versatilità in termini di applicazioni (ad esempio, stampa incorporata e sacrificale23,33, fabbricazione di strutture cave34,35,ecc.). Le principali sfide che preoccupano gli studi attuali includono il trasferimento da strutture 2D a 3D, la formazione di una fitta rete di tubi cavi ad alta risoluzione spaziale e l’integrità meccanica complessiva e la fedeltà della forma durante il flusso fluido nella coltura cellulare 30.

L’approccio più semplice al tessuto perfutilizzabile è la fabbricazione di una rete interconnessa di canali all’interno del costrutto. La creazione di tali canali perfutilizzabili all’interno di uno scaffold di tessuto dovrebbe risolvere molti dei problemi di cui sopra, in quanto consente immediatamente la diffusione di nutrienti e ossigeno rimuovendo i prodotti di scarto. Pertanto, la formazione potenziale di regioni necrotiche all’interno del costrutto è evitata36. Tali canali possono inoltre essere semiizzati con cellule endoteliali (EC) e servire come vasi sanguigni artificiali in modelli di tessuto 3D37. Nel senso più elementare, un vaso può essere costituito da un canale cavo, uno strato morbido di EC e un guscio rigido. Recentemente, l’estrusione 3D di due materiali diversi in modo core/shell utilizzando aghi co-assiali per l’estrusione ha guadagnato molto interesse38,39,40,41, in quanto consente la fabbricazione di tubi cavi.

Simile alla stampa 3D a microestrusione convenzionale, la stampa core/shell viene eseguita con un ugello coassele (adesempio, due aghi con diametri diversi allineati sullo stesso asse in modo, in modo che l’ago più ampio racchiuda quello più stretto). Così, due materiali possono essere estruso contemporaneamente, con uno come il filamento centrale o nucleo “interno” e un secondo come il guscio “esterno”41. Fino ad oggi, la biostampa coassiale è stata utilizzata per fabbricare strutture con solidi42, core/shell43e fili cavi40,44; tuttavia, i materiali utilizzati non sono stati ottimizzati sia per la vitalità ottimale delle cellule che per la robustezza meccanica dei costrutti stampati. Come accennato, la tecnica offre la possibilità di combinare biomateriali con diverse proprietà meccaniche, in cui quello più rigido supporta quello più morbido. Ancora più importante, se il materiale ponteggio (ad esempio, alginato, cellulosa carboxythyl) viene estruso come il guscio, mentre il nucleo composto dall’agente di collegamento incrociato (ad esempio, cloruro di calcio) viene erogato dal capillare interno e poi risciacquato possibile fabbricare un tubo cavo continuo in un unico passaggio45.

Con questo in mente, è stato sviluppato un metodo semplice e ripetibile in un solo passaggio per costruire scaffold ben definiti e perfutilizzabili per l’ingegneria di strutture vascolari e altri tessuti tubolari. Per sviluppare una tecnologia economicamente vantaggiosa, la fabbricazione dovrebbe idealmente essere un processo a passo singolo. Pertanto, un set-up core/shell è stato adattato e integrato nel biostampante 3D. Il disegno di base è costituito da un ugello centrale in metallo per evitare la deformazione durante l’iniezione, intorno al quale viene posizionato un secondo ugello di diametro maggiore. Tale impostazione di ugelli coassiale consente la co-estrusione dei due flussi e il collegamento incrociato immediato del canale idrogel estruso. Ciò consente la fabbricazione diretta di filamenti cavi multistrato, mentre il successivo collegamento incrociato con concentrazioni più elevate di cloruro di calcio (CaCl2) garantisce una maggiore stabilizzazione permanente dall’esterno.

Come tale, questo metodo consente la stampa simultanea di scaffold e microcanali, in cui i filamenti di idrogel cavo fungono da scaffold per supportare l’integrità meccanica dei costrutti 3D e contemporaneamente agiscono come microcanali integrati per fornire sostanze nutritive per la crescita delle cellule. Questo protocollo fornisce una procedura dettagliata della strategia di biostampa 3D core/shell basata sull’uso di un ugello coassiale su misura in cui le strutture idrogel 3D con canali integrati vengono fabbricate controllando il cross-linking per produrre filamenti cavi, rimangono perfutilizzabili durante la coltura cellulare.

Il set-up di stampa 3D utilizzato in questo lavoro è configurato come descritto in precedenza da Banovi e Vihar46 e può essere diviso in tre componenti principali: A) un set-up meccanico CNC a tre assi con 50 – m precisione di posizionamento nelle direzioni X, Y, e z; B) due estrusori, adattati per siringhe monouso, da 5 mL, con risoluzione voxel a 1,2 lecc; e C) controllo dell’elettronica e del software.

Per facilitare la stampa del nucleo/guscio, è stato sviluppato un ugello appropriato che può essere montato su uno degli estrusori (estrusore primario, stampa del nucleo) ed è compatibile con gli aghi smussati G27. Ha anche la compatibilità luer-lock per connettersi con il secondo estrusore (stampa ndo la shell). I primi prototipi sono stati fabbricati inserendo un ago Di G27 contundente (diametro interno – 210 m, diametro esterno – 410 m) in un ago G21 (diametro interno , 510 m, diametro esterno 820 m) o punta conica G20 (diametro interno eedle lateralmente per fornire il materiale del guscio. Tuttavia, a causa della leggera piegatura dell’albero dell’ago, non è possibile produrre una punta dell’ugello con allineamento concentrico degli aghi interni ed esterni.

Per risolvere questo problema, è stato ideato un nuovo design dell’ugello che soddisfaceva i seguenti criteri: 1) può essere prodotto utilizzando un mulino CNC a 3 assi, 2) può essere realizzato da vari materiali (materie plastiche ad alte prestazioni, come PEEK o metalli), 3) ha compatibilità luer-lock per l’applicazione del materiale di guscio, e 4) è compatibile per un ago smussato G27 e lo tiene in posizione in due posizioni per allineare la punta con l’asse centrale. Uno schema del prototipo dell’ugello è illustrato nella Figura 1.

Protocol

1. Preparazione di idrogel e soluzioni di collegamento incrociato In breve, mescolando vigorosamente, sciogliere le polveri ALG e CMC in acqua ultra-pura per ottenere un totale 3 wt% ALG e 3 wt% soluzione CMC.NOTA: in questo lavoro, per la stampa vengono utilizzate siringhe da 5 mL; pertanto, la quantità finale di materiale viene regolata a tale volume. Tuttavia, per altre cartucce di estrusione e dimensioni dei campioni stampati, la quantità di materiale preparato deve essere scalata di conseguenza. Aggiungere 1,5 wt% nanofibre di cellulosa alla miscela ALG-CMC per un ulteriore rinforzo meccanico per raggiungere la viscosità desiderata, adatta per la stampa. Agitare la sospensione idrogel fino a quando omogeneo utilizzando un mixer overhead.NOTA: Nessuna fibra o bolla dovrebbe essere presente nell’idrogel. Preparare la soluzione da 10 mL di cloruro di calcio (CaCl2)da 10 mM in acqua ultra-pura, utilizzata come soluzione primaria di collegamento incrociato per la stampa. Preparare 10 mL di 5 wt.% soluzione CaCl2 in acqua ultrapura, che viene utilizzata come soluzione di collegamento incrociato secondario nella post-elaborazione di scaffold.NOTA: Generalmente, tutte le formulazioni di idrogel, che sono adatte per il cross-linking chimico immediato, consentono la fabbricazione in un solo passaggio di tubi cavi e possono essere utilizzati con questo tipo di nucleo / guscio set-up. I meccanismi di stampa e collegamento incrociato devono essere ottimizzati di conseguenza. La viscosità dell’idrogel varierà a seconda della composizione desiderata; tuttavia, può essere regolato con le concentrazioni di polimeri e l’aggiunta di agenti ispessimento (ad esempio, nanofibre). La viscosità ideale per la stampa 3D di strutture stabili è abbastanza alta da mantenere la forma del filamento estruso e per l’impalcatura di contenere il proprio peso prima del collegamento incrociato. 2. Stampa core/shell di scaffold perfuse Prima della stampa, sterilizzare il biotipografo spruzzando accuratamente il 70% di etanolo ed esponendolo alla luce UV per 1 h. Accendere il biotipografo ed eseguire il software di controllo, che viene fornito in un pacchetto con la stampante 3D. Eseguire la procedura di homing premendo l’icona Home. Utilizzo del comando della barra degli strumenti File Import G-Code, importa lo scaffolding generato g-code. Trasferire l’idrogel in una siringa sterile da 5 mL e posizionarlo in uno dei supporti estrusori della stampante 3D. Tramite il lucatrice e un tubo corto, collegarlo all’ingresso di collutore laterale dell’ugello del nucleo/guscio. Trasferire la soluzione di collegamento incrociato (100 mM CaCl2) a un’altra siringa sterile da 5 mL con un ago smussato G27 collegato e inserirlo nel supporto superiore dell’ugello del nucleo/guscio. L’ago interno dovrebbe sporgere leggermente (1 mm) dall’ugello del nucleo esterno/guscio. Regolare l’allineamento manualmente. Inserire la seconda siringa nel supporto di estrusione. Per inserire correttamente le siringhe nei supporti (impostazione illustrata nella Figura 2), controllare manualmente entrambi i supporti di estrusione facendo clic sulle frecce A e B e Su e Giù. Prima dell’inizio della stampa, estrudere separatamente l’idrogel e la soluzione di collegamento incrociato per eliminare tutte le bolle d’aria in eccesso nell’ugello del nucleo/guscio e garantire un flusso continuo di idrogel. Utilizzando le frecce , Su e Giù, regolare manualmente la distanza tra l’ugello e il substrato di stampa. Si consiglia di utilizzare un substrato piatto, vetro-stampa, che ha una buona adesione. L’ugello di estrusione non deve essere a contatto con il substrato per consentire un flusso ininterrotto dell’idrogel. La distanza ottimale tra l’ugello e il substrato (altezza del livello) è in genere la stessa della larghezza del diametro esterno dell’ugello, ma viene regolata in base al materiale utilizzato e ai singoli parametri di stampa. Regolare l’altezza di stampa iniziale in base alle esigenze individuali. Premere il pulsante Riproduci per avviare il processo di stampa.NOTA: Si consiglia di includere la stampa di una gonna (Figura 3) che circonda l’impalcatura per garantire la posa di un filamento cavo omogeneo prima che inizi la stampa dell’impalcatura effettiva. Per ottenere un flusso ottimale di idrogel con l’intenzione di stampare scaffold ottimali, variare la composizione della formulazione, la composizione della soluzione con collegamento incrociato e i parametri di stampa (ad esempio, velocità di stampa, pressione di estrusione, temperatura di stampa, distanza tra substrato ed ugello di estrusione, ecc.). Dopo la stampa, rimuovere con attenzione il substrato con l’impalcatura stampata e versare la soluzione di collegamento incrociato secondario (5 wt.% CaCl2)sull’intero scaffold per garantire il collegamento incrociato sull’intero ponteggio. Incubare per 1 min a temperatura ambiente (RT).NOTA: assicurarsi che l’intero scaffolding sia immerso nella soluzione di collegamento incrociato. Questo passaggio è fondamentale per ottenere le proprietà di resistenza desiderate dello scaffold, ma varia a seconda del materiale e del metodo di collegamento incrociato utilizzato. Utilizzando un bisturi tagliare manualmente il materiale gonna in eccesso. Sterilizzare le impalcature sotto una luce UV per 30 min. capovolgere con attenzione l’impalcatura e ripetere il processo di sterilizzazione. Staccare con cura l’impalcatura dal substrato tirandola delicatamente lateralmente. Se l’impalcatura aderisce fortemente al substrato, separarla inserendo un bordo tagliente tra di loro. Trasferire l’impalcatura in un supporto di coltura cellulare incolore (DMEM integrato con 5 wt.% FBS, 100 U/mL penicillina e 1 mg/mL streptomicina), e incubarli a 37 gradi centigradi in un’atmosfera contenente 5 wt.% CO2 per almeno 24 h. 3. Preparazione di cellule endoteliali e soluzione di saggio vivo / morto Per la coltura cellulare, preparare il mezzo avanzato di coltura cellulare DMEM con aggiunto fenolo rosso e integrarlo con 5 wt.% FBS e 2 mM L-glutamine. Aggiungere 100 U/mL di penicillina e 1 mg/mL di streptomicina. Avviare la linea di cellule endoteliali della vena ombelicale umana (HUVEC) e passare in conformità con i protocolli di coltura HUVEC come descritto47.NOTA: Si raccomanda di colturare le cellule nei mezzi di coltura cellulare con il rosso fenolo aggiunto per una semplice visualizzazione durante l’iniezione delle cellule in scaffold bianchi traslucidi come descritto di seguito. Per il conteggio cellulare, pipette 100 L di cellule sospese nei mezzi di coltura cellulare e colorate con 900 .L di 0,1 wt.% soluzione blu trypan. Utilizzare un contatore cellulare automatizzato o un emocitometro manuale per contare e ottenere il numero stimato di celle in sospensione. Per il saggio vivo/morto, preparare una soluzione di 4 mM Calcein-AM e 2 mM di iodio di propidium in PBS sterile.NOTA: la soluzione live/dead deve essere preparata direttamente prima di condurre il test. 4. Trasferire le celle in scaffold Rimuovere le impalcature dai mezzi di coltura cellulare e trasferirle in una parabola Petri di vetro sufficientemente grande. Immediatamente prima di iniettare le cellule nelle impalcature, dissociare gli HUVEC dai flaconi utilizzando il trattamento da 0,25 wt.% trypsin. In breve, smaltire i mezzi di coltura cellulare e incubare le cellule con 0,25 wt.% trypsin (2 mL) per 5 min a 37 . Dopo l’incubazione aggiungere 3 mL di colture cellulari alle cellule tripsinizzate e trasferire tutte le cellule staccate in un tubo di centrifuga. Centrifugare le cellule a 200 x g per 5 min e smaltire il super-natante. Risospendere le cellule nei mezzi di coltura delle cellule fresche. Contare le celle come descritto in precedenza. Regolare la concentrazione totale delle cellule in base alle esigenze individuali. In questo lavoro, viene utilizzata una concentrazione iniziale di 340.000 cellule/mL. Risospendere le cellule in una siringa sterile con un ago G27 smussato attaccato. Trovare un punto di ingresso e iniziare a iniettare con attenzione le cellule nelle impalcature. La sospensione cellulare scorrono attraverso uno scaffold traslucido dovrebbe essere visibile. Assicurarsi che l’intero scaffoldsi si riempia di sospensione cellulare. Sommergi le impalcature nei mezzi di coltura cellulare e incubale a 37 gradi centigradi in un’atmosfera contenente 5 wt.% CO2 per un massimo di 10 giorni. Ricostituire i mezzi di coltura cellulare in base alle esigenze sperimentali. 5. Saggio vivo/morto e imaging cellulare Dopo l’incubazione, sciacquare le impalcature con PBS. Con un ago smussato, iniettare con cura la soluzione live/dead precedentemente preparata (4 mM calcein-AM e 2 mM propidium iodide in PBS) negli scaffold e incubarli in PBS per 30 min a 37 gradi centigradi. Assicurarsi che la soluzione scorra lungo la lunghezza dell’intero scaffold. Sciacquare le impalcature con PBS. Trasferire con attenzione le impalcature in uno scivolo di vetro. Osservare le cellule tinte direttamente nelle impalcature al microscopio a fluorescenza.NOTA: Le cellule vitali producono fluorescenza verde e le cellule morte emettono luce di fluorescenza rossa.

Representative Results

L’obiettivo di questo lavoro era quello di sviluppare un ugello nucleo/guscio facile da produrre con compatibilità luer per la stampa core/shell di strutture a legna. Inoltre, è stato descritto un protocollo di stampa semplice e ripetibile in un solo passaggio, che è semplice da modificare e ospita un’ampia gamma di materiali e diversi meccanismi chimici di collegamento incrociato per costruire scaffold ben definiti e perfutilizzabili per l’ingegneria di strutture vascolari e di altre strutture del tessuto tubolare. Ugello del nucleo/guscioL’ugello è composto da un ago smussato G27 (per la stampa del filamento assiano interno) e dal corpo dell’ugello, che tiene l’ago in posizione e crea un ugello esterno per il filamento del guscio con una porta di connessione per l’input del materiale. Uno schema è illustrato nella Figura 1. Due siringhe da 5 mL, che vengono inserite nei singoli estrusori e forniscono i materiali di base e di guscio. Tubing collega il corpo dell’ugello con la siringa, fornendo il materiale del guscio. L’assemblaggio completo dell’ugello core/shell e della configurazione della siringa è illustrato nella Figura 2. Il primo prototipo funzionale del corpo dell’ugello è stato prodotto dalla fresatura CNC di un blocco di poloxymetilene (POM). La compatibilità e la sigillazione tra l’elemento, un ago G27 e tubi è stato testato installando in Vitaprint. Nessuna perdita del materiale del guscio è stata osservata nell’ugello, nel connettore luer-lock o tra corpo e ago. Il corpo dell’ugello si adatta perfettamente al mozzo dell’ago (connettore di aletta), garantendo il movimento sincronizzato dell’intero ugello con l’estrusore. Edificio di scaffoldL’approccio più diretto alla fabbricazione di scaffold consiste nel depositare i materiali strato per strato in cui la direzione di stampa viene modificata ogni strato consecutivo, in genere con un angolo di 90 gradi. A causa delle proprietà visco-elastiche e igroscopiche degli idrogel, mantenere la fedeltà della forma delle strutture stampate rimane difficile. Lo scopo principale di questa sezione del protocollo è la stampa 3D di scaffold core/shell perfutilizzabili utilizzando due polimeri, che in precedenza hanno mostrato risultati promettenti per la costruzione di scaffold (ALG e CMC) con l’aggiunta di nanofibre di cellulosa (NFC) per stabilità meccanica. Sia ALG che CMC sono copolimeri lineari solubili in acquae 48 ed entrambi contengono gruppi di carboxyl, che possono essere interconnessi con l’aggiunta di cations divalenti. Le particelle di Ca2 o più formano legami ionici con due gruppi funzionali contemporaneamente, formando connessioni tra catene di polimeri, aumentando la rigidità del gel. Stampa di scaffold perfutilizzabiliLo scopo di questo processo è quello di stampare in 3D semplici strutture di scaffold in legno, che si estendono su diversi strati e mantengono la loro fedeltà di forma e la perfusabilità fino a diventare completamente interconnessi. Ciò richiede anche la coestrusione del nucleo e del guscio senza movimenti di crossover o retrazione, che possono interrompere il flusso. Pertanto, i tipici metodi di modellazione e sezionamento CAD sono meno adatti. In questo lavoro, viene utilizzato un g-code progettato manualmente e un generatore di codice g basato su python è stato sviluppato per una preparazione rapida del codice g. Le impalcature erano strutturate a forma di griglia in legno e costruite su una superficie di vetro piatto. La fabbricazione è stata eseguita strato per strato, depositando le linee di attraversamento di ogni strato successivo in un angolo di 90 gradi rispetto al precedente. Inoltre, ogni strato con successo era del 2% più stretto nelle direzioni X e Y, garantendo un supporto continuo del filamento mediante strati precedenti. La distanza tra i filamenti (dimensione macropore) può essere progettata con precisione nel codice g tenendo conto del diametro esterno del filamento estruso (0,8 mm) e della distanza tra le linee della griglia (3 mm). Gli scaffold erano tenuti a soddisfare i criteri chiave di inclusione per un’ulteriore considerazione. In primo luogo, gli scaffold con almeno 4 strati di altezza erano necessari per mantenere la loro integrità strutturale e la geometria (ad esempio, le dimensioni dei macropori) durante la stampa, per essere idonei per un ulteriore sviluppo. In secondo luogo, gli scaffold dovevano rimanere perfutilizzabili (microcanali stabili) anche dopo essere stati incubati per 7 giorni nei media di coltura cellulare a 37 gradi centigradi. A intervalli di tempo appropriati (1, 2, 5 e 7 giorni) gli scaffold sono stati tolti dai supporti di coltura e testati per vedere se erano ancora perfutilizzabili. Nella figura 4A, la sezione trasversale di uno scaffold appena stampato e post-elaborato visualizza un canale cavo chiaramente visibile all’interno del filamento. Nella figura 4B, è chiaro che anche dopo l’incubazione di 72 h nei mezzi di coltura cellulare a 37 , il filamento mantiene la struttura cava attraverso l’intera lunghezza dello scaffold. Diverse formulazioni erano stampabili, sono rimaste strutturalmente stabili, hanno conservato la geometria stampata e sono rimaste perfabili; tuttavia, un solo è stato scelto per ulteriori test (ad esempio, 3 wt.% ALG – 3 wt.% CMC – 1,5 wt.% NFC), che ha permesso la stampa di scaffold perfutilizzabili con un massimo di 10 strati. Il processo di stampa con l’ugello personalizzato è illustrato nella figura 5A. La stampa core/shell era possibile con formulazioni meno viscose; tuttavia, i gel con concentrazioni più elevate non consentivano un flusso continuo attraverso l’ugello. Per il collegamento incrociato primario (materiale di base, consegnato durante la stampa) è stato utilizzato 100 mM CaCl2, che ha adeguatamente stabilizzato la formazione continua di un filamento cavo, senza causare la solidificazione del gel all’interno dell’ugello. Dopo la stampa, gli scaffold sono stati immersi in una soluzione CaCl2 da 5 wt.% per incrociare completamente l’idrogel per la fedeltà della forma a lungo termine. Un esempio di scaffold è illustrato nella figura 5B. Durante l’ottimizzazione, il processo di formulazione è stato utilizzato un colorante artificiale nella soluzione di base, per consentire la valutazione visiva ed esaminare la qualità del filamento estruso. Il tintura non è stato utilizzato per la fabbricazione delle impalcature finali, che sono state preparate per la semina cellulare e la coltivazione. Asdetto vivo/mortoDopo l’incubazione, un saggio vivo/morto è stato utilizzato per visualizzare le EC e distinguere tra le cellule viventi (verdi) e le cellule morte (rosse) all’interno dell’impalcatura incubata. Ciò ha comportato due scopi principali: A) per determinare se gli scaffold forniscono un ambiente biocompatibile per promuovere la crescita e l’adesione senza mostrare effetti nocivi sulla cellula, e B) per visualizzare l’integrità strutturale delle strutture tubolari e delle loro sistema di canali interni in modo più dettagliato. I risultati del saggio live/dead sono riportati nella figura 6. In presenza di espaginazioni intracellulari, la membrana plasmatica permeabile Calcein-AM viene convertita in Calcein, emettendo luce a fluorescenza verde nelle cellule vive. D’altra parte, le cellule apoptotiche sono visualizzate dalla membrana impermeabile iodide propidio, che fluoresce in rosso quando intercastata nel DNA doppia elica. Immagini dal vivo / morte e immagini a campo luminoso di scaffold sono stati combinati per aiutare a visualizzare le cellule all’interno dei canali vuoti. La soluzione di colorazione è stata iniettata, e il saggio eseguito direttamente negli scaffold stampati in 3D dopo l’incubazione a cellule di scaffold per 48 h. Va notato che è stata utilizzata una densità di semina relativamente piccola di ECs (340,000 cellule/mL), in quanto questo studio è servito solo come prova di concetto per la stampa core/shell di scaffold perfabili. La conclusione più significativa del saggio vivo/morto è che anche dopo 48 h, non sono state osservate cellule morte (rosso), dimostrando che né il materiale di impalcatura stesso, né i suoi prodotti di degradazione hanno mostrato effetti tossici. Inoltre, le EC hanno di fatto aderito e rimangono attaccate all’interno delle impalcature e sembravano formare agglomerati distribuiti uniformemente quando coltivati all’interno dei canali. Ciò suggerisce che il metodo di fabbricazione descritto e la formulazione dello scaffold forniscono un quadro adatto per la costruzione in vivo, rilevanti, morfologie del tessuto tubolare. Oltre a imitare le interazioni cellulare-ECM e la stretta comunicazione cellulare-cellula in tutte e tre le dimensioni spaziali, l’ingegneria dei tessuti complessi richiede anche un’esposizione costante delle cellule a un nuovo mezzo per sostenerne la vitalità. Questo a sua volta può essere raggiunto da una fitta rete di canali in continua perfusione, che richiede ulteriori indagini in lavori futuri, e richiederà l’ottimizzazione dei materiali e dei parametri di crescita per facilitare l’ingegneria tissutale a lungo termine della vascolatura. Figura 1: Prototipo dell’ugello del nucleo/guscio. (A) Vengono mostrati il design complessivo e i componenti principali del prototipo del corpo dell’ugello. L’ugello viene completato inserendo un ago G27 smussato attraverso la parte superiore. I supporti dell’ago superiore e inferiore immobilizzano e riallineano l’ago con l’asse dell’ugello, assicurando che la punta si estenda dall’ugello attraverso il centro.  Per collegare l’ugello con materiale “shell” estruso dalla siringa secondaria, il tubo con un connettore luer-lock è collegato all’ingresso laterale. Da qui, il materiale viene inoltrato all’ugello attraverso un canale stretto. La fabbricazione del canale menzionato richiede la perforazione in due posizioni, producendo fori che devono essere limitati dopo la produzione). (B) Mostrato è un primo piano dell’ugello con un ago G27 inserito, che si estende fuori dall’ugello. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 2: configurazione finale del nucleo/guscio. (A) Mostrato è l’ugello del nucleo/guscio completato con siringhe correttamente attaccate contenenti l’idrogel (a destra), costruendo il “guscio” e la soluzione di collegamento incrociato (a sinistra) estruso come il “core”. (B) Mostrato è il set-up core/shell installato nel sistema Vitaprint con due estrusori. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 3: codice G dell’impalcatura tubolare. Qui viene mostrata una schermata del software della stampante, in particolare l’anteprima del percorso (A) e il codice g non elaborato del primo livello (B). Il codice g è un insieme di istruzioni con coordinate di destinazione in direzioni spaziali assolute (X, Y, z), nonché estrusione (A,B) in direzioni relative. Il comando G determina il tipo di istruzione, mentre G1 rappresenta il movimento lineare verso le coordinate di destinazione e G92 determina la posizione iniziale iniziale. Inoltre, la velocità di avanzamento dei seguenti comandi è determinata con l’istruzione F in mm/min. Figura 4: Sezione trasversale di un filo di impalcatura con un interno cavo. (A) Mostrato è la sezione trasversale dello scaffold appena stampato e post-elaborato. (B) Mostrato è la fetta trasversale dell’impalcatura dopo essere stata incubata nei mezzi di coltura cellulare per 72 h. Mentre la forma dell’ugello definisce l’estrusione di un tubo con una sezione trasversale rotonda, il filamento sembra essere in qualche modo appiattito sulla deposizione. Il canale interno, tuttavia, rimane intatto e mantiene la sua forma durante l’incubazione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 5: Stampa Core/shell di scaffold. Qui vengono mostrate la fabbricazione (A) di un’impalcatura a tubo cavo a tre strati e della sua forma finale (B). Per una migliore visualizzazione, la soluzione di collegamento incrociato nel nucleo è stata macchiata con un coloranti rosso. La formulazione presenta una stabilità meccanica sufficiente per mantenere la stabilità dello scaffold, anche se vengono fabbricate strutture più spesse (fino a 10 strati, dati non visualizzati). Le dimensioni esterne della struttura finale erano circa 27 mm x 27 mm x 3,5 mm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 6: analisi dal vivo/morto eseguita direttamente negli scaffold. Una sospensione degli HUVEC è stata iniettata nel canale dell’impalcatura interna, incubata per 48 h e trattata con coloranti vivi/morti. Gli HUVEC vitali emettono luce a fluorescenza verde, che è rappresentata nelle macchie luminose dell’immagine. Le cellule morte emettono luce a fluorescenza verde; tuttavia, nessuno è visibile nell’impalcatura osservata. La distribuzione delle cellule significa anche la forma e mantenuto capacità di perfusione dei canali. In misura minore, la soluzione di analisi vivo/morto ha anche macchiato il materiale di impalcatura, producendo fluorescenza leggera al microscopio. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussion

Design dell’ugello
Utilizzando l’ugello nucleo/guscio sviluppato, integrato in un sistema Vitaprint a due estrusori, le impalcature tubolari cave sono state fabbricate in un processo a passo singolo. Per ottenere uno spessore uniforme della parete del tubo attraverso la maggior parte delle impalcature preparate, l’ago deve essere posizionato centralmente sull’asse dell’anello di estrusione esterno. Gli aghi calibro standard mostrano spesso una leggera, ma significativa eccentricità fuori dall’asse. Così, il corpo dell’ugello è stato progettato per tenere l’ago in due punti, una volta in alto (fissando il mozzo) e una volta prima della camera finale nucleo / guscio (fissando la cannula stessa), correggendo il suo allineamento assioso. La precisione dell’allineamento assiale aumenta con la distanza tra il punto di fissaggio. C’è, tuttavia, un compromesso tra la lunghezza dell’ago e il volume disponibile della camera dell’ugello. Per migliorare ulteriormente la funzionalità dell’impostazione, è possibile implementare alcune modifiche dell’ugello: A) un supporto dell’ugello con una migliore stabilità, B) ugelli aggiuntivi per una più ampia gamma di compatibilità dell’ago, C) un meccanismo di regolazione preciso per l’ago posizionamento dell’ugello, e D) integrando ulteriori ingressi e dispositivi microfluidici per la preparazione del materiale al volo.

Ottimizzazione idrogel
Per determinare il rapporto ALG:CMC ottimale, sono state valutate diverse iterazioni di materiale. Generalmente, la stampa core/shell con concentrazioni superiori a 3 wt.% di entrambi i componenti è stata resa impossibile, perché non ha permesso un flusso continuo di idrogel o ha provocato l’intasamento dell’ugello. In particolare, la concentrazione di ALG al di sopra di 3 wt.% ha aumentato eccessivamente la viscosità e ha provocato un intasamento degli ugelli, mentre concentrazioni più basse di ALG e concentrazioni di CMC più elevate (>3 wt.%) hanno rallentato i tempi di cross-linking e quindi non sono riuscite a fornire sufficienti concentrazioni di CMC (>3 wt.%) supporto strutturale dell’impalcatura. La stampa core/shell era possibile con formulazioni meno viscose; tuttavia, la viscosità del gel estruso deve essere sufficiente a sostenere la fedeltà della forma a lungo termine. Alla fine, un rapporto 1:1 ALG:CMC è stato dimostrato di essere la scelta più adatta che conferma uno studio precedente di Maver et al.49. L’aggiunta di NFC ha migliorato significativamente la stampabilità e la rigidità strutturale degli scaffold stampati core/shell, ma non ha avuto alcun effetto significativo sulle proprietà di collegamento incrociato del materiale.

Le applicazioni personalizzate, ottimizzate per specifici tipi di cellule e set-up sperimentali, richiederanno materiali di impalcatura ben su misura, che varieranno nei meccanismi di composizione e di collegamento incrociato. Il metodo descritto in questo lavoro si basa su una soluzione di polimeri misti alginato-cellulosa, che è cross-linked ionicamente utilizzando ioni Ca2o. Lo stesso alginato è un polimero lineare di blocchi di residui (1,4) collegati a (M) collegati a z-d-mannuronato (M) e di residua a z-l-guluronate (G) che possono essere intercollegati reversibilmente ionicamente mediante l’applicazione di Ca2 e altre cazioni divalenti come Sr2,Br2,Mg 2o. Tuttavia, lo ione più utilizzato per il collegamento incrociato di algeriato rimane Ca2 , sotto forma di CaCl2. La ca2 può essere utilizzata anche sotto forma di CaSO4 o CaCO3; tuttavia, la bassa solubilità di CaSO4 rispetto a CaCl2 significa una gelazione più lenta. CaCO3 produce tempi di gelazione ancora più lenti che possono portare a proprietà meccaniche deboli e incoerenti.

Tempi di gelazione più lunghi in genere producono un costrutto più omogeneo, tuttavia, alcune applicazioni, come la stampa core/shell richiede velocità di gelazione veloci50. Gli ioni Mg2 o inducono anche la gelazione; tuttavia, la loro efficienza di collegamento incrociato è di circa 5x-10 volte inferiore, rispetto a Ca2 ,con tempi di cross-linking di 2-3 h. Inoltre, gli ioni di magnesio sono più selettivi verso le unità soluroniche, quindi il collegamento incrociato dipende più dalla composizione chimica dell’ALG51. In questo caso, un rapido tasso di gelazione è essenziale per garantire una formazione continua del canale cavo prima che la struttura cava possa collassare. CaCl2 produce il tasso di gelazione più veloce, che è fondamentale per la deposizione diretta di filamenti cavi. 100 mM CaCl2 è stato utilizzato, che ha adeguatamente stabilizzato la formazione continua di un filamento cavo senza causare la solidificazione del gel all’interno dell’ugello.

Stampa e post-elaborazione di scaffold
I seguenti passaggi devono essere presi in considerazione durante questa parte del processo, compreso 1) assicurando che tutte le soluzioni e i materiali, incluso il biostampante 3D, siano sterilizzati correttamente prima della stampa. 2) Quando si prepara l’idrogel, l’omogeneità del materiale è fondamentale per la stampa continua. L’introduzione di impurità o bolle d’aria dovrebbe essere evitata, in quanto possono ostruire l’ugello e/o interrompere l’estrusione. 3) Le siringhe devono essere collegate correttamente all’ugello del nucleo/guscio tramite il meccanismo di luer-lock e correttamente inserite nei supporti estrusori come si vede nella Figura 2A,B. 4) Prima di stampare una struttura complessa, si consiglia di pre-estrudere una piccola porzione del gel e soluzione di collegamento incrociato per eliminare le bolle d’aria in eccesso nell’ugello nucleo/guscio e garantire un flusso continuo di idrogel. Questo può essere incorporato direttamente nel codice g per migliorare la ripetibilità. 5) È utile aggiungere una gonna che circonda l’impalcatura per garantire la posa di un filamento cavo omogeneo prima che inizi la stampa dell’impalcatura stessa.

Inoltre, 6) per migliorare l’adesione tra il filamento di stampa e il substrato, si consiglia di utilizzare una superficie piana con una buona adesione (cioè un vetrino di vetro o un piatto Petri). 7) L’ugello di estrusione non deve essere a contatto diretto con il substrato per consentire un flusso ininterrotto dell’idrogel. La distanza iniziale avrà un forte impatto sulla qualità della stampa, ma lo spessore del filamento estruso è una buona approssimazione dell’impostazione iniziale. 8) L’altezza di stampa iniziale nel codice g deve essere regolata in base alle esigenze individuali. Dopo aver ottimizzato i parametri di stampa, il codice g di scaffolding deve essere importato nel software Planet CNC e il processo di stampa avviato come descritto nel protocollo. 9) Per controllare e ottimizzare il flusso di idrogel con l’intenzione di stampare scaffold ottimali, sia la composizione della formulazione che i parametri di stampa devono essere variati (ad esempio, velocità di stampa, pressione di estrusione, temperatura di stampa, distanza tra il substrato e ugello di estrusione, altezza del livello, dimensione dell’impalcatura, ecc.).

In generale, sono necessarie velocità di flusso più elevate per stampare formulazioni con maggiore viscosità. Come accennato, tutte le formulazioni di idrogel, che sono adatte per il cross-linking chimico immediato, consentono la fabbricazione in un solo passaggio di tubi cavi e possono essere utilizzati con il nucleo descritto / guscio set-up. I meccanismi di stampa e collegamento incrociato devono essere ottimizzati di conseguenza. Dopo la stampa, tutti gli scaffold sono stati post-elaborati mediante il collegamento incrociato secondario con la soluzione 5 wt.% CaCl2, che ha assicurato il collegamento incrociato completo del componente ALG-CMC e sterilizzato da entrambi i lati sotto una luce UV per almeno 30 minuti. Dovrebbe essere assicurato per inghiottire completamente l’impalcatura con la soluzione di collegamento incrociato e incubare abbastanza a lungo per completare il processo di collegamento incrociato. La post-elaborazione differirà in base al materiale e al meccanismo di collegamento incrociato utilizzati, che devono essere considerati in anticipo. Dopo la post-elaborazione, gli scaffold devono essere rimossi con attenzione dal substrato, trasferiti ai mezzi di coltura cellulare e incubati in un’atmosfera controllata per almeno 24 h prima della semina cellulare. L’utilizzo di un mezzo incolore migliorerà la visibilità della sospensione cellulare durante l’iniezione negli scaffold.

Asdetto vivo/morto
La soluzione live/dead deve essere preparata direttamente prima di condurre l’analizzatore e tenerla all’oscuro prima di condurre il saggio, in quanto contiene coloranti a fluorescenza che sono inclini allo sbiancamento. Dopo il tempo di incubazione desiderato, i mezzi di coltura cellulare devono essere accuratamente scartati intorno alle impalcature e sciacquati con PBS. Idealmente, lo stesso punto di ingresso dovrebbe essere utilizzato per la semina cellulare seguita dal saggio vivo / morto iniettato nelle impalcature.

Importanza dei risultati
Sia ALG che CMC sono già stati utilizzati per promuovere l’angiogenesi in vitro. Sulla base delle sue caratteristiche ECM-mimetiche, del cross-linking fisico e della biocompatibilità, ALG è stato comunemente impiegato come componente per la consegna e il rilascio controllato di fattori di crescita angiogenici (ad esempio, bFGF, HGF, VEGF164 e Ang-1)rispettivamente) 52 ,53,54. Inoltre, in combinazione con la gelatina, CMC è stato utilizzato anche per incapsulare le cellule endoteliali vascolari a causa delle sue capacità di collegamento rapido in condizioni fisiologiche55. NFC sono stati aggiunti per aumentare ulteriormente la stabilità meccanica e la fedeltà della forma degli scaffold. Va sottolineato che l’obiettivo non era quello di migliorare la vascolarizzazione, ma di dimostrare la possibilità di produrre scaffold perfutilizzabili e cavi ALG-CMC, stampati in modo core/shell, che facilitano anche l’attaccamento e la proliferazione di Gli HUVEC. La scelta di utilizzare una miscela ALG-CMC si basava sui risultati di materiali di base comunemente usati, facilmente accessibili e biocompatibili che potevano consentire la stampa core/shell dei canali vuoti. Molti altri materiali possono essere opzioni più praticabili per migliorare l’angiogenesi; tuttavia, alcuni non sono adatti per la stampa core /shell, in quanto non facilitano la rapida gelazione /cross-linking, che è fondamentale in questo approccio.

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gli autori desiderano riconoscere il sostegno finanziario per questo progetto ricevuto dall’Agenzia slovena per la ricerca (numeri di sovvenzione: P3-0036 e I0-0029), e dal Ministero della Scienza, dell’Istruzione e dello Sport (numero di sovvenzione: 5442-1/2018/59).

Materials

Alginic acid sodium salt Sigma-Aldrich (Germany) 180947 powder; Mw ~80,000
ATTC HUV-EC-C [HUVEC] LGC Standards (UK) ATCC-CRL-1730 Endothelial Cell Growth Supplement (ECGS) and unidentified factors from bovine pituitary, hypothalamus or whole brain extracts are mitogenic for this line; the cells have a life expectancy of 50 to 60 population doublings.
Axiovert 40 inverted optical microscope Carl Zeiss Microscopy GmbH (Germany) three contrastingtechniques in one objective – e.g. brightfield,phase contrast and PlasDIC
Calcium chloride Sigma-Aldrich (Germany) C1016 anhydrou; granular; ≤7.0 mm; ≥93.0%
Cellulose nanofibrils suspension (NFC, 3% (w/v)) The Process Development Center, University of Maine (Maine, USA) nominal fiber width of 50 nm; lengths of up to several hundred microns
ELGA Purelab water purification system Veolia Water Technologies (UK)
EVOS FL Cell Imaging System ThermoFisher Scientific Inc. (Germany) AMF4300 a fully integrated, digital, inverted imaging system for four-color fluorescence and transmitted-light applications
Gibco Advanced Dulbecco’s modified Eagle’s medium (Advance DMEM) ThermoFisher Scientific Inc. (Germany) 12491015 high glucose; no glutamine; phenol red
Gibco Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) ThermoFisher Scientific Inc. (Germany) 21063029 high glucose; L-glutamine; HEPES; no phenol red
Gibco Fetal Bovine Serum (FBS), qualified ThermoFisher Scientific Inc. (Germany) 10270106 FBS origin: Brazil; 5 % (w/v) FBS
Hypodermic Sterican needle B. Braun Melsungen AG (Germany) 9180117 0.40 x 25mm, 27G x 1''
L-glutamine Sigma-Aldrich (Germany) G3126 ReagentPlus®, ≥99% (HPLC)
Live/Dead Cell Double Staining Kit Sigma-Aldrich (Germany) 4511 contains calcein-AM and propidium iodide (PI) solutions; suitable for fluorescence
Nunc EasYFlask cell culture flasks ThermoFisher Scientific Inc. (Germany) 156367 Nunclon Delta certified for monolayer formation, cloning efficiency, non-cytotoxic, non-pyrogenic, and sterility; filter caps; culture area of 25 cm2
Omnifix syringe B. Braun Melsungen AG (Germany) 4617053V 5 mL Luer Lock
Penicillin G sodium salt Sigma-Aldrich (Germany) P3032 powder; BioReagent; suitable for cell culture
Phosphate buffered saline Sigma-Aldrich (Germany) P4417 tablet; one tablet dissolved in 200 mL of deionized water yields 0.01 M phosphate buffer, 0.0027 M potassium chloride and 0.137 M sodium chloride, pH 7.4, at 25 °C
Sodium carboxymethyl cellulose Sigma-Aldrich (Germany) 419338 powder; average Mw ~700,000
Streptomycin sulfate salt Sigma-Aldrich (Germany) S9137 powder; BioReagent; suitable for cell culture
Ultra-pure water Veolia Water Technologies (UK) 18.2 mΩ cm at 25⁰C
VitaPrint 3D bio-printer IRNAS (Slovenia)
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Milojević, M., Vihar, B., Banović, L., Miško, M., Gradišnik, L., Zidarič, T., Maver, U. Core/shell Printing Scaffolds For Tissue Engineering Of Tubular Structures. J. Vis. Exp. (151), e59951, doi:10.3791/59951 (2019).
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