Murine линии на основе модели хронического ингибивания CDK9 для изучения широко распространенных негенетических дефектов транскрипционной удлинения (TEопределенно) в раках
Summary
Протокол детализирует модель карциномы in vitro murine негенетической дефектной удлиненности транскрипции. Здесь, хроническое ингибирование CDK9 используется для подавления продуктивного удлинения РНК Пол II вдоль провоспалительных генов ответ для имитации и изучения клинически overserved TEопределенно явление, настоящее примерно в 20% всех типов рака.
Abstract
Мы ранее сообщали, что подмножество раковых заболеваний определяется глобальной транскрипционной дерегуляции с широко распространенными недостатками в удлинении транскрипции мРНК (TE) – мы называем такие виды рака, как TEопределенно. Примечательно, что TEопределенно рака характеризуются ложной транскрипции и неисправной обработки мРНК в большой набор генов, таких как интерферон / JAK / STAT и TNF / NF-ЗБ пути, что приводит к их подавления. TEопределенно подтип опухолей в почечно-клеточной карциномы и метастатической меланомы пациентов значительно коррелируют с плохой реакцией и результатом в иммунотерапии. Учитывая важность исследования TEопределенно рака, как это предвещает значительный блокпост против иммунотерапии-цель этого протокола заключается в создании в пробирке TEопределенно мыши модели для изучения этих широко распространенных, не генетических транскрипционные аномалии в раковых заболеваниях и получить новые идеи, новые использует для существующих препаратов, или найти новые стратегии против таких видов рака. Мы подробно использование хронического флавопиридола опосредованного торможения CDK9 для отмены фосфорилирования остатков серина 2 на C-терминале повторенного домена (CTD) РНК-полимеразы II (РНК Пол II), подавляя выпуск РНК Пол II в продуктивную транскрипцию Удлинение. Учитывая, что TEопределенно рака не классифицируются под какой-либо конкретной соматической мутации, фармакологическая модель является выгодным, и лучше всего имитирует широко распространенные транскрипции и эпигенетические дефекты наблюдается в них. Использование оптимизированной сублетальной дозы флавопиридола является единственной эффективной стратегией в создании обобщенной модели негенетических широко распространенных нарушений в пробертионации и дефектах обработки мРНК, тесно имитирующих клинически наблюдаемые TE определенно характеристики. Таким образом, эта модель TEопределенно может быть использовандля для вскрытия, клеток автономных факторов, позволяющих им в противостоянии иммунной опосредоченной атаки клеток.
Introduction
Ограничивающим ключевую ставку шагом в выражении почти всех активных генов является переход РНК-полимеразы II (РНК Пол II) от промоторно-проксимальной паузы к продуктивному удлинению1,2. Учитывая, что эпигенетическая дисрегуляция транскрипционной удлинения помогает в прогрессировании нескольких злокачественных новообразований человека определяется как TEопределенно, что приводит к субоптимальной сигнализации в провоспалительных пути реагирования, что составляет плохой ответ и результат иммунотерапии3, общей целью этого протокола является создание полезной модели in vitro для изучения этих широко распространенных негенетических транскрипционных аномалий при раковых заболеваниях. В этом свете использование хронического фармакологического ингибирования CDK9 является эффективной стратегией для создания обобщенной модели негенетических широко распространенных нарушений в удлинении транскрипции и дефектов обработки мРНК. Обоснование мнимой по задиы использования хронического торможения CDK9 является то, что он аннулирует фосфорилирование остатков серина 2 на C-терминале повторного домена (CTD) РНК Pol II, тем самым подавляя выпуск РНК Пол II в продуктивной удлинение транскрипции. Кроме того, TEопределенно рака, описанные ранее нашей группой3, не классифицируются под какой-либо конкретной соматической мутации. Поэтому негенетическая (фармакологическая) модель выгодна и лучше всего имитирует широко распространенные транскрипционные и эпигенетические дефекты, наблюдаемые в них. Метод здесь детализирует поколение и характеристику хронической модели обработки flavopiridol обработки клеток рака murine. Этот метод явно нарушает удлинение транскрипции по генам, характеризующихся более длинной геномной длиной, с готовыми промоутерами и индуцированными выражениями, такими как TNF/NF– B и интерферон/STAT сигнализация, глубоко контролируемая на уровне транскрипции удлинения3,4,5. В целом, это оптимизированная модель линии клеток морин транскрипционного удлинения – единственная модель, к нашим знаниям для изучения недавно описанных опухолей TE определенно-диски устойчивость к противоопухолевой иммунной атаки, что делает полезную систему для использования и изучить уязвимости негенетических дефектов в основных транскрипционных механизмов в раковых заболеваний по отношению к иммунной опосредошной атаки клеток.
Protocol
Representative Results
Discussion
Контроль удлинения РНК Пол II стал решающим рычагом для регулирования стимул-ответных экспрессии генов в пользу злокачественных клеток5,7,8. Преодоление промоутер-проксимальной паузы на удлинение и последующее производство мРНК требуе…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была частично поддержана NCI (CA193549) и CCHMC Research Innovation Pilot награды Какаджан Комуров, и Министерство обороны (BC150484) награду Навнит Сингх. Содержание является исключительно ответственностью авторов и не обязательно представляют официальные взгляды Национального института рака или Министерства обороны. Спонсоры не принимали никакого значения в разработке, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.
Materials
| hhis6FasL | Cell Signaling | 5452 | |
| 10X TBS | Bio-Rad | 170-6435 | |
| 12 well plates | Falcon | 353043 | |
| 20% methanol | Fisher Chemical | A412-4 | |
| 24-well plates | Falcon | 351147 | |
| 4–18% SDS polyacrylamide gel | Bio-Rad | 4561086 | |
| 4% Paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | AAJ19943K2 | |
| 5% dry milk | Bio-Rad | 170-6404 | |
| 7-Methylguanosine antibody | BioVision | 6655-30T | |
| 96-well plates | Cellstar | 655180 | |
| AF647-conjugated mouse CD8 | Biolegend | 100727 | |
| antibiotic and antimycotic | Gibco | 15240-062 | |
| anti-His antibody | Cell Signaling | 2366 P | |
| Anti-Rabit | Cell Signaling | 7074 | Dilution 1:5000 |
| Anti-Rat | Cell Signaling | 7077S | Dilution 1:5000 |
| Bradford assay Kit | Bio-Rad | 5000121 | |
| BSA | ACROS Organics | 24040-0100 | |
| BV421-conjugated mouse CD45 | Biolegend | 109831 | |
| crystal violet | Sigma | C3886-100G | |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | |
| Dynabeads Oligo (dT)25 | Ambion | 61002 | |
| FBS | Gibco | 45015 | |
| Fixable Live/Dead staining dye e780 | eBioscience | 65-0865-14 | |
| Flavopiridol | Selleckchem | S1230 | |
| H3k36me3 | Abcam | ab9050 | Dilution 1:2000 |
| IFN-α | R&D systems | 12100-1 | |
| IFN-γ | R&D systems | 485-MI-100 | |
| IMDM | Gibco | 12440053 | |
| Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate | Millipore | WBKLS0500 | |
| MojoSort Mouse CD8 T Cell Isolation Kit | Biolegend | 480007 | |
| NF-κB | Cell Signaling | 8242s | Dilution 1:1000 |
| PBS | Gibco | 14190-144 | |
| p-NF-κB | Cell Signaling | 3033s | Dilution 1:1000 |
| p-Ser2-RNAPII | Active Motif | 61083 | Dilution 1:500 |
| p-Ser5-RNAPII | Active Motif | 61085 | Dilution 1:1000 |
| p-STAT1 | Cell Signaling | 7649s | Dilution 1:1000 |
| RiboMinu Eukaryote Kit | Ambion | A10837-08 | |
| RIPA buffer | Santa Cruz Biotechnology | sc-24948 | |
| RNAPII | Active Motif | 61667 | Dilution 1:1000 |
| STAT1 | Cell Signaling | 9175s | Dilution 1:1000 |
| TNF-α | R&D systems | 410-MT-010 | |
| total H3 | Cell Signaling | 4499 | Dilution 1:2000 |
| Tri reagent | Sigma | T9424 | |
| Triton | Sigma | T8787-50ML | |
| Tween 20 | AA Hoefer | 9005-64-5 | |
| β-Actin | Cell Signaling | 12620S | Dilution 1:5000 |
| β-ME | G Biosciences | BC98 |
References
- Adelman, K., Lis, J. T. Promoter-proximal pausing of RNA polymerase II: emerging roles in metazoans. Nature Reviews Genetics. 13 (10), (2012).
- Margaritis, T., Holstege, F. C. Poised RNA polymerase II gives pause for thought. Cell. 133 (4), 581-584 (2008).
- Modur, V., et al. Defective transcription elongation in a subset of cancers confers immunotherapy resistance. Nature Communications. 9 (1), 4410 (2018).
- Hargreaves, D. C., Horng, T., Medzhitov, R. Control of inducible gene expression by signal-dependent transcriptional elongation. Cell. 138 (1), 129-145 (2009).
- Adelman, K., et al. Immediate mediators of the inflammatory response are poised for gene activation through RNA polymerase II stalling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (43), 18207-18212 (2009).
- van Stipdonk, M. J., Lemmens, E. E., Schoenberger, S. P. Naïve CTLs Require a Single Brief Period of Antigenic Stimulation for Clonal Expansion and Differentiation. Nature Immunology. 2 (5), 423-429 (2001).
- Gilchrist, D. A., et al. Regulating the regulators: the pervasive effects of Pol II pausing on stimulus-responsive gene networks. Genes & Development. 26 (9), 933-944 (2012).
- Danko, C. G., et al. Signaling pathways differentially affect RNA polymerase II initiation, pausing, and elongation rate in cells. Molecular Cell. 50 (2), 212-222 (2013).
- Nechaev, S., Adelman, K. Pol II waiting in the starting gates: Regulating the transition from transcription initiation into productive elongation. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Gene Regulatory Mechanisms. 1809 (1), 34-45 (2011).
- Zhou, M., et al. Tat modifies the activity of CDK9 to phosphorylate serine 5 of the RNA polymerase II carboxyl-terminal domain during human immunodeficiency virus type 1 transcription. Molecular and Cellular Biology. 20 (14), 5077-5086 (2000).
- Palancade, B., Bensaude, O. Investigating RNA polymerase II carboxyl‐terminal domain (CTD) phosphorylation. European Journal of Biochemistry. 270 (19), 3859-3870 (2003).
