האדם הנגזר iPSC האנטי נטוורקס רשתות על Multiwell מיקרו מערכים אלקטרודה לפעולה ונשנים הקלטות פוטנציאליות
Summary
מאמר זה מכיל קבוצה של פרוטוקולים לפיתוח של האדם המושרה הנגרמת לתאי גזע (היפנוsc-CM) רשתות המתורבתות על לוחות בעלי השפעה מרובת המידות כדי electroporate הפיך קרום התא עבור מדידות פוטנציאליות פעולה. הקלטות תפוקה גבוהה מתקבלות מאותם אתרי תא במשך ימים ברציפות.
Abstract
הקרנת בטיחות הלב היא בעלת חשיבות עליונה לגילוי סמים וtherapeutics. לכן, ההתפתחות של הרומן החדשני התפוקה החשמלית אלקטרופיסיולוגית ההכנות הנגזרות היפנוסי-CM (היסק-ס) נדרשת הרבה עבור בדיקות תרופות יעילות. למרות מערכים רב אלקטרודה (אני) מועסקים לעתים קרובות עבור מדידות פוטנציאליות בשדה של תאים להתרגש, פרסום שנערך לאחרונה על ידי Joshi-מוקהרג ועמיתים תיאר ואימת את היישום שלה עבור הקלטות פוטנציאליות של פעולה חוזרת (AP) מאותה הכנה היפנוסי-CM בימים. המטרה כאן היא לספק שיטות מפורטות צעד אחר צעד לזריעת CMs ולמדידת צורות AP גל באמצעות אלקטרופורציה עם דיוק גבוה וברזולוציה טמפורלית של 1 μs. גישה זו מטפלת בחוסר מתודולוגיה קלה לשימוש כדי להשיג גישה תאיים למדידות AP בתפוקה גבוהה לחקירות אלקטרו-פיזיולוגיות אמינות. זרימת עבודה מפורטת ושיטות לציפוי היפנוסי-CMs בלוחות מרובת היטב מפורטים בדגש על שלבים קריטיים בכל מקום רלוונטי. בנוסף, מותאם אישית MATLAB סקריפט לטיפול בנתונים מהירה, החילוץ והניתוח הוא דיווח לחקירה מקיפה של ניתוח צורת גל כדי לכמת הבדלים עדינים במבנה של פרמטרים שונים המשך AP מעורב הפרעה בקצב הלב והקרדיולוקסיטי.
Introduction
תאי גזע בעלי השפעה של האדם (היפנוטית-CMs) הם תקן הזהב עבור מספר גדל והולך של מעבדות1,2,3,4,5,6 ,7,8,9,10 מכות embryoidגופות 11,12,13 ומונאולייר3,7,10,11,12 , 13,14,15,16,17 בידול הן השיטות המועדפות עבור הפקת הקרדיוציט ומערך רב-אלקטרודה (MEA) הפך למודאליות משותפת לניטור האלקטרו-דינמיקה של רשתות אלה18,19,20. בעוד פרמטרים שניתן לחלץ מתוך פוטנציאל השדה (FPs) כגון קצב המכות, משרעת, משך מרווחי RR הם תגובות אלקטרופיזיולוגיות בסיסית של הכאתו ספונטנית monolayers18,21, 22,23, הרכיבים הפוטנציאליים לפעולה (AP) מתבססים על אותות בעלי כלים אלה, קשה לנחש24. הפרסום האחרון שלנו על גילוי של יישום של אני עבור מדידות ap חוזרים ישירה מספק הוכחה של מתודולוגיה עבור מופת למופת מחדש ap לדוגמה עם ניתוח בצורת גל נרחב בשלבים שונים רה-פולריזציה על פני מספר אצוות הקרדיוציט הנגזרות מרשת3. במחקר הדגמנו כי המסירה של פולסים אלקטרופורטינג לרשתות של הקרדיוציטים הנגזרות מאפשרת גישה תאיים להקלטות AP. הקלטות AP זמניות אלה תלויות בהחלמה פוטנציאלית על שחזורים פוטנציאליים שנצפו דרך הפגיעה באתר3,25,26. צורות גל שנרשמו דרך ה-MEA ו-מלחציים טלאי במחקר שלנו הראה AP מורפולוגיות דומות ובכך לאמת את האמינות של הגישה3.
כמה מעבדות דיווחו על מדידת גישה מתוך תאים אלקטרוגניים שונים באמצעות מותאם אישית אני בנוי18,21,26,27,28,29, 30, אך המהימנות של שימוש ב-אני למדידות AP עקביות וחוזרות לא הוערך. כיום, תקן זהב תיקון מהדק הטכניקה מוגבלת הקלטות מסוף7,31 בעוד, מאה מבוססי AP מדידות הם ארעי ולכן ניתן לנהל מספר פעמים על אותו תא. כמו כן, אנו מראים שניתן להקליט בקלות אותות AP איכותיים בטווח המילי-וולט המחייב סינון מינימלי. החוקרים יכולים אפוא לנהל לא רק חריפה אלא גם לימודי סמים כרוניים בהכנות אותן באמצעות אני. בנוסף, טכנולוגיה זו מאפשרת במקביל FP/AP מדידה הפקת ספריות אלקטרו-biome בפרק זמן קצר. בהינתן הדגש הגובר על חיזוי הפרעה בקצב הלב והתרופות24,32,33,34,35, שילוב של מדידת AP גישות ישפרו את בטיחות הסמים ואת הערכות היעילות.
כאן, אנו מציגים פרוטוקולים עבור 1) ציפוי מראש של cryopreserved-CMs עבור התבגרות, 2) הנתק והציפוי של היפנוsc-CMs על מרובת היטב, 3) הקלטה של FPs ו-APs מרשתות היפנוסי-CM, 4) הפחתה וחילוץ הנתונים לניתוח, ו 5) שחזור המערכים לשימוש חוזר מרובים. כל שלב ממוטב להדגיש שלבים קריטיים בכל מקום שהוא רלוונטי. דרישות עבור מצורף לתא כדי להבטיח מכות מונאולייר המוקשר הם דנו ונהלים עבור שחזור מאה הטוב ביותר עבור מחקרים אלקטרולוגיים חוזרים מוסברים. לבסוף, GUI מותאם אישית שפותחה במעבדה מוצגת להפקת אות AP, אבטחת איכות, ופילוח זרימת עבודה כדי לכמת ולנתח פרמטרים AP.
Protocol
1. הכנת פתרונות וחומרים (ראה לוח חומרים) 6-היטב רקמות-רקמה צלחת המצע-ציפוי הפשרת מצע הציפוי בקרח או ב -4 ° c. הכינו 1:100 המצע לדילול הציפוי ב-DMEM דיום קר/F12 בינונית. לערבב את הפתרון על ידי ליטוף איטי. העברה 2 מ ל של המצע הציפוי הפתרון (שלב 1.1.2) לבאר של שישה היטב התרבות רקמה לוחית. מיד למקם את צלחת תרבות הרקמה מצופה בחממה תרבות התא ב 37 ° c ו 5% CO2 עבור לפחות 7 h ולהשתמש בתוך 7 ימים. היפנוסק-CM תרבות בינונית הוסף 10 מ ל של תוסף מדיה CM המוסדר ב-4 ° צ’ עד 500 mL של מדיום בסיס CM. החנות ב-4 ° צ’ למשך עד 2 שבועות. מספר המדיה הנדרש עבור היום ולהביא לטמפרטורת החדר לפני השימוש. היפנוסק-ס התקן בינוני: להכין טרי על ידי ערבוב בינונית תרבות היפנוsc-CM (שלב 1.2) עם 10% סרום בפרה העובר (FBS). הביאו את התקשורת לטמפרטורת החדר לפני ההחדרה של CMs להשעיה. Fibronectin 1 mg/mL פתרון מלאי: Aliquot 200 μL לתוך 1.5 mL microfuge צינורות סטרילי ומאוחסן ב 4 ° צ’ לשימוש מאוחר יותר. הכנת פתרון עבודה של 50 μg/mL ריכוז טרי על קרח. הפתרון ניקוי multiwell: לשלב 0.5 g של ניקוי אנזימטי עם 50 מ ל של מים סטרילי כפול מזוקקים (ddH2O). מערבולת לערבב את התוכן. לסנן ולאחסן ב-4 ° צ’ עד שבוע. 2. ציפוי מראש של קריופהיבס-CM להבשלה (איור 1) הערה: סעיף זה מיועד התאגף ו culturing היפראס-CMs כי הובונו באמצעות שיטת מאכיל ללא ממזין3,16 ו קריואופטית בחנקן נוזלי 10 ימים לאחר בידול ב 1-2 מיליון תאים/בקבוקון. תאים ממבחנה אחת מצופים לשתי בארות מצופי מצע של צלחת התרבות 6-היטב. קרדיוציטים נוטים להתיישב בתחתית הצינור כך ערבוב עדין בזמן הציפוי מראש חשוב להשגת צפיפות תאים אפילו ברחבי הבארות. התקן 2 מ ל של FBS לכל בקבוקון של היפרsc-CMs להיות מופשרים לתוך שפופרת של 15 מ”ל ו להביא לטמפרטורת החדר. הפשרת מבחנות של הקפאת ההישמורות-CMs על ידי הצבת אותם ב 37 מעלות צלזיוס באמבט מים ו מערבולת בעדינות עבור אפילו להפשיר עבור לא יותר מ 3 דקות. מיד להעביר את תכולת המבחנה לצינור המכיל FBS (ראה שלב 2.1), לערבב על ידי מתערבל צנטריפוגה ב 200 x g עבור 5 דקות. מנושף את הסופרנטאנט ומשהה מחדש את הגלולה בתא 1 מ ל של היפרג בינונית (ראה שלב 1.3) לכל מבחנה. השתמש בפיפטה העברה כדי להשעות. את הגלולה באמצעות טריטורציה עדינה . להעריך את הכדאיות בתאים הוסף נוסף 3 מ ל של היפכנף בינוני בבקבוקון של היפנוסק-CM המופשב צעד 2.4 ולהשעות בעדינות באמצעות העברת הצנרת כדי להוסיף עוד גושי תאים. מדבקות 2 מ ל של התא הבולם בעדינות לתוך כל באר של מצופה מצע 6-היטב צלחות (ראה שלב 1.1). מניחים בחממה לתרבות התא ב-37 ° c ו-5% CO2. החלף בינוני טרי בינונית-CM culturing לאחר 24 שעות ו 3 פעמים שבועי לאחר מכן עבור 20 ימים.הערה: תאים לדבוק ציפוי מצע על ידי 24 h והיכו באופן ספונטני ב 48 h לאחר הציפוי (ראה וידאו 1 ו- video 2). 3. מולטיולוחית מרובת וסירוס וציפוי (איור 2 ואיור 3) הערה: הפרוטוקול המתואר כאן הוא להכנת לוחיות הרישוי של הרכב 24-ובכן עם 12 מיקרו-אלקטרודות מצופות זהב על זכוכית לציפוי היפנוסי ס. להימנע מלגעת בתחתית הצלחת כמו זה עלול לגרום נזק אלקטרודות. יומיים לפני ציפוי התא, להוסיף 0.5 mL של התרבות בינונית החברה (ראה שלב 1.2) לכל טוב ולבצע הקלטה בסיסית כדי לאמת את היחס אות לרעש עבור בדיקת איכות של האני. לשטוף את התקשורת, שטוף עם ddH מעוקר2O ולעקר תחת אור UV בתוך כיפה זרם למינארי. ביום לפני ציפוי התא, להוסיף 0.1 mL של fbs לכל טוב עבור הטיפול ידרופילי של משטחי MEA. המשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. שלב זה נחוץ עבור הקובץ המצורף לתא. מנושף את FBS ולשטוף עם 0.5 מ ל של סטרילי ddH2O לכל טוב. . חזור על זה שוב השאירו את הצלחת להתייבש במכסה הזרם הלמינארי בלילה. להכין דילול עובד של 50 μg/mL fibronectin קר DMEM/F12 בינוני מהמלאי (ראה שלב 1.4). . שמור על הפתרון בקרח פיפטה 5 μL של דילול העובדים (ראה 3.6) ובזהירות לחלק את ה-droplet למרכז של כל באר כדי לכסות את כל 12 האלקטרודות. חשוב לעבוד במהירות על פני 24 הבארות כדי למנוע את ה-droplet מייבוש. מיד למקם את fibronectin מצופה בצלחת multiwell דיל על משטח מוגבה בתוך מחולל לחות המכיל ddH סטרילי2O לכסות את משטח הכלים כולו. מניחים את החדר עם הצלחת מרובת היטב עבור 3 h בחממה תרבות התא.הערה: הצבת הצלחת 24 הטוב בחדר מחולל לחות הוא קריטי כדי למנוע טיפות fibronectin מייבוש במהלך תקופת הדגירה. 4. היפנוסק-ס לדיסוציאציה וציפוי בצלחת מרובת ובעל (איור 3) הערה: הפעל שלב זה כ 1 h לפני הדגירה של מאה fibronectin הושלמה. ודא שפתרון הדיסוציאציה של התאים נמצא ב-37 ° c והמדיום iPSC-CM בטמפרטורת החדר. שיטות דיסוציאציה כבר אופטימיזציה עבור 30 ימים לאחר הבדיל היפנוsc-CMs תרבותית על מצופה מצע 6-היטב צלחות (ראה שלב 2) כדי להשיג כ 90% ניהול CMs עבור הציפוי של MEA. הטיפול צריך להילקח לא להציג בועות אוויר תוך הימנעות כדי למנוע מוות תאים. מנושף את מדיום התרבות מכל הבאר של הצלחת התרבות 6-היטב הרקמה עם 30 יום לאחר הבדיל תרבות היפנוסי-CM (ראה שלב 2.7) ולשטוף עם 2 מ”ל של D-PBS סטרילי לכל טוב. הוסף 1 מ ל של פתרון הדיסוציאציה מראש של תא מחומם (ראה טבלת חומרים) לטוב ו-הדגירה 4 דקות ב 37 ° c. השתמש בפיפטה העברה כדי להפעיל בעדינות כדי לשחרר תאים לניתוק. אם רוב התאים הם עדיין חסיד, הדגירה עבור אחר 3 דקות ב 37 ° c ו קצוצות שוב. הדגירה הנוספת צריכה לעזור להתאוששות מקסימלית של תאים. אין לבצע המשך יותר מ -7 דקות מכיוון שפעולה זו עלולה לגרום לכדאיות של תאים נמוכים. שימוש בפיפטה העברה, מאגר כל התאים שאינם מופרים לתוך צינור חרוט המכיל בינונית היפרג-CM (ראה שלב 1.3). מומלץ להשעות את התאים לפחות פי שניים מאמצעי התקשורת (2 מ”ל לכל היותר להיות מקוצרים) כדי לחסום את הפעילות של פתרון הדיסוציאציה של התא. צנטריפוגה ב 200 x g עבור 5 דקות. משמת את הפתרון בזהירות כמו הגלולה הוא מחובר באופן רופף על פני השטח ולהשעות את 0.1 mL של היפנוsc-CM מדיום. להשתמש בצנרת העברה כדי להשעות את הגלולה כמה פעמים על ידי trituration עדין. Aliquot 2 μL של תאים הנתק ולדלל עם 18 μL של מדיה ב 1.5 mL microfuge שפופרת. הוסף 20 μL של טריפי כחול וערבב עבור ספירת תאים והערכת הכדאיות. כוונן את צפיפות התא ל-6,000 תאים/μL על-ידי הוספת הנפח המתאים של אמצעי האחסון של התקן היפנוsc-CM. להשעות את הגלולה על ידי מצליף עדין כמה פעמים. ההיסק-CMs מתנתק בקלות ממשטחי זכוכית במיוחד כאשר הם מצופים בצפיפויות גבוהות. יש לנו אופטימיזציה של צפיפות הזריעה ואת תנאי הציפוי כדי להשיג 15 ימים של הקלטות חשמל. כאשר מוכנים, להביא את הצלחת מרובת היטב לתוך כיסוי הזרם למינארי עבור זריעת תאים. זה קריטי לבצע את שני השלבים הבאים אחד טוב בכל פעם כדי למנוע את fibronectin מייבוש. הסר בזהירות את droplet הפיברוטין באמצעות מP10 באמצעות פיפטה מבלי לגעת באלקטרודות. באופן מיידי לוותר על 5 תא μL (30,000 תאים) למרכז הבאר של הצלחת ה-MEA כיסוי כל 12 אלקטרודות. חזרו על השלב עד לציפוי כל 24 הבארות. ערבוב של השעיית תאים לסירוגין על ידי מצליף מומלץ. מניחים את הצלחת מרובת היטב בחזרה בתוך לחות מכוסה באופן רופף החדר ולחזור לחממה תרבות התא ב 37 ° צ’ ו 5% CO2 עבור 3 h עבור תא מצורף. בזהירות להוסיף 200 μL של היפנוט-CM התאגף בינונית לכל טוב מבלי להפריע את התאים באמצעות מP200. הוסף את הדרוכי המדיה לצד הבאר. מניחים את הצלחת מרובת היטב בחזרה בחממה תרבות התא. החלף במדיום התרבות הטרייה החדשה בציפוי 24 שעות. הכאה ספונטנית של קרדיוציטים ניתן לצפות בשלב זה (ראה וידאו 3). לשנות את התקשורת כל יומיים עד סוף הניסויים. 5. היפנוציה-ס מ ורכישת אותות (דמויות 4 – 6) הערה: פרוטוקול זה מיועד להקלטה בו של אותות אלקטרודה בתפוקה גבוהה (12 אתרים לכל אחת מ -24 הבארות). מערכת מרובת היטב של המערכת משמשת עם תוכנת הרכישה (ראה טבלת חומרים). כל ההקלטות ב-MEA מתבצעות ב-37 ° c. הפעל את לוח הממשק ואתחל את תוכנת הרכישה. אפשר מספיק זמן לשלב ה-MEA הרב ביותר להגיע לטמפרטורה 37 ° c (ראה חץ מס ‘ 1 באיור 4). הוסף צלחת מרובת היטב לוחית משלב 4 לתוך השלב הקדמי של מאה הארבע על ידי הצבת אותו מכוסה על פלטפורמת ההקלטה ולחץ על כפתור ההוספה (ראה חץ מס ‘ 2 באיור 4). אפשר לייצב את הטמפרטורה לפני תחילת ההקלטות. כוונון הגדרות הרכישה והאלקטרופורציה לחצו על הסמל ‘ הגדר זרימה ניסיונית ‘ (ראו חץ מס ‘ 3 באיור 4) וקבעו זמן הקלטה ל-2 דקות או כרצונכם. לחץ על סמל הגדרת הרכישה של הנתונים (ראה חץ מס ‘ 4 באיור 4) והגדר קצב דגימה ל-20 kHz, מסנן למעבר גבוה ל-0.1 hz ומסנן למעבר נמוך ל-3500 hz. לחץ על סמל הגדרות הגירוי (ראה איור 5). תחת הכרטיסייה הגדרת גירוי , הגדר גירוי כפולסים במתח סימטרי של 1 mV, 1 ms ו-1 Hz. תחת הכרטיסיה אלקטרודות גירוי , בחר אתרי אלקטרופורציה על-ידי סימון כל האלקטרודות הרלוונטיות. לחץ על כפתור לחקור כדי להמחיש אותות בכל הבארות. אמת את איכות האות ואת תנאי המצב הקבוע. רשום הערות על אלקטרודות עם אותות FP בטווח ה-mV. לחץ על אותו לחצן כדי לעצור את החיפושים. לא נרשמו נתונים עד לנקודה זו. התחל להקליט על ידי לחיצה על כפתור Go! האלקטרודות בכל באר תציג אותות FP בחלון נתונים גולמיים (איור 6). לאחר 30 s של הקלטה, לחץ על כפתור לעורר ולאפשר אלקטרופורציה להתקיים על האתרים הנבחרים עבור 30 s; לאחר מכן, לחץ על כפתור אותו כדי לעצור גירוי ולהמשיך הקלטה עבור 60 s הנותרים.הערה: ניתן להפעיל את הקובץ שהוקלט בחזרה על-ידי מעבר אל מצב Replayer בתפריט הנפתח ‘ יישום ‘. 6. multiwell MEA לוחית ניקוי לשימוש חוזר לאחר הניסויים הסופיים, לנקות את כל הבארות בצלחת multiwell יטב על ידי מרוקן את כל תכני המדיה מכל היטב הימנעות בזהירות לגעת משטח האלקטרודה. הוסף 1 מ ל של מסוג ddH2O סטרילי לכל טוב. . מנושף וחוזר פעם אחת הוסף 0.3 mL של הפתרון ניקוי multiwell יטב (ראה שלב 1.5) לכל טוב. דגירה לילה בטמפרטורת החדר כדי להוציא תאים ופסולת. למחרת בבוקר, מנושף את הפתרון ולשטוף עם 1 מ ל של סטרילי ddH2O. הדגירה עבור 5-7 דקות ומלא. . אני חוזר 5 פעמים הוסף 0.5 mL של הניקוי ddH2O סטרילי לכל טוב. הקלט את קו הבסיס של צלחת הניקוי הנקי לבדיקת איכות של העצמי הנקי (איור 7). אחסן ב-4 ° c עד שהוא מוכן לשימוש. 7. קובץ נתונים המרה וייצוא הערה: ארבעה קבצי נתונים ייווצרו עבור כל הקלטה: MWR, MWR, MWR ו-MWR. באמצעות תוכנת הממיר, ניתן להמיר את הקובץ MWD לקובץ H5 לצורך ניתוח עוקב באמצעות סקריפט שנבנה בהתאמה אישית (ראה קובץ משלים 1). הפעל את תוכנת הממיר (ראה טבלת חומרים). בחר ‘ קבע נתיב קלט ‘ מתפריט הקובץ. בחר תיקיה המכילה קבצי נתונים מעניינים. בחרו ‘ קבע נתיב פלט ‘ מתפריט הקובץ. בחר תיקיה שבה יישמרו קבצים שהומרו. הדגש קובץ MWD של ריבית. לחץ על הלחצן ‘ ייצוא ל-HDF5 ‘. 8. פילוח וניתוח נתונים (איורים 8-10) הערה: תוכנה מותאמת אישית מבוססת Matlab משמשת לפלח ולחילוץ פרמטרי נתונים מסוגים שונים של FP ו-AP. התוכנה זמינה לפי דרישה. הפעל את קוד ניתוח צורת גל באמצעות Matlab (ראה איור 8 לתצוגה של החלון הראשי של GUI). לחץ על הקובץ ובחר בתהליך. h5. חפש ובחר את הקובץ mwd. h5 שנוצר בהתאם לשלב 7 לעיל. לחץ על הלחצן ‘ שמור ספרייה ‘ כדי לשנות את מיקום האחסון של קבצי הפלט. צור תור עיבוד אותות על-ידי בחירה באפשרות אלקטרודה/שילובים של ריבית ולאחר מכן לחיצה על לחצן התור . חזור על שלב זה כדי להוסיף שילובים נוספים של אלקטרודות/היטב שיעובדו לתור. ערוך את התור על-ידי לחיצה ישירה על שם הרפואה/ריכוז מד אם התאים טופלו בסמים (איור 8). לאחר סיום התור, לחץ על הלחצן ‘ אתחל טפסי גל ‘. זה יתחיל את העיבוד הראשוני שבו אותות מזוהים ומופק עבור פילוח. לחץ על לחצן התקרבות ובחר את אזור הפעולה הפוטנציאלי של העניין עם הסמן (איור 9). לחץ על כפתור לשמור ולסקור את הלוחות. פסגות (אדום ‘ x ‘) ושקתות (עיגולים צהובים) מזוהים עבור כל צורת גל ואת הפוטנציאל המנורמל הפעולה מונחים. לחץ על לחצן שמור ועבור אל הסימן הבא בתור (איור 10). חזור על שלבים 8.8-8.9 עבור יתר האלקטרודה/הצירוף אותות היטב בתור.הערה: קובץ . csv ייווצר עם פרמטרי apd שנמדדו עבור כל צורת גל. קובץ. mat עבור כל קובץ . h5 נשמר גם כדי לאפשר עיבוד נוסף של נתונים מקוטע.
Representative Results
הכדאיות וצפיפות הציפוי של היפנוסק-CMs שלאחר הפשאת, היא קריטית לתרבות מרובת היטב. ציפוי מראש של 1-2 מיליון היסק-CMs/בקבוקון לשתי בארות של לוח התרבות 6-היטב הרקמה עם 50% או הכדאיות יותר יפיק תרבות מונאולייר בריא עם מכות ספונטניות ב 48 h. הכדאיות המסכנה של CMs תגרום לתרבויות עם אחוז גבוה של אוכלוסיות לא מיוציט. Monolayers אלה כאשר מיונתק עבור הציפוי מאה הטוב בדרך כלל לייצר תוצאות לא עקביות אותות באיכות רעה, ולכן צריך להיות מושלך. איור 1 מציג דוגמאות של תרבויות אופטימלית לעומת משנה אופטימלית של היפנוsc-CMs ב-48 h. להתאים את CMs על לוחיות התרבות מצופה מצע רקמות ולא ישירות על מרובת היטב, מאפשר שחזור התא והתבגרות3. ציפוי ישיר של הקפאה של CMs במערך אינו מומלץ כפי שהוא הפיק תוצאות לא עקביות. בנוסף לאיכות של CMs הנתק, תא מצורף ב-multiwell יטב MEA הוא תלוי מאוד בצפיפות התא ואת טכניקת ציפוי fibronectin. גודל ה-droplet fibronectin הוא קריטי כמו CMs יהיה להתאים את גבולות האזור מצופה fibronectin. מסיבה זו, רק 5 μL של פתרון fibronectin הם ויתרו ישירות על אזור מערך אלקטרודה. כדי להבטיח כי droplet לא להתפזר, המשטח היטב חייב להיות יבש לחלוטין בזמן הציפוי. איור 2 מציג את הפריסה של הצלחת ה-MEA הרב עם תרשימים של שלב אחר שלב טיפול מקדים להכנה אופטימלית. בנוסף, כדי למנוע את fibronectin מייבוש לוחיות מרובת היטב יש להציב בתוך חדר מחולל לחות במהלך תקופת הדגירה הנמשכת לא יותר מ 3 h (ראה שלב 3.8). לאחר תקופת הדגירה הושלמה, חשוב להסיר את ה-droplet של fibronectin מכל באר בדיוק לפני ציפוי ס מ ורק לאחר מכן להמשיך לציפוי היטב הבא. עבודה במהירות ובזהירות של CMs הוא המפתח המצורף לתא מוצלח. תרבות היפנוטית ב -30 ימים לאחר בידול מיונתק לציפוי מאה הטוב ביותר באמצעות שיטת הדיסוציאציה של התא האנזימטי (ראה שלב 4). CMs יהיה לצרף את המשטחים מצופה fibronectin על ידי 3 h ו דופלקס המכסה את המערכים יהיה גלוי לאחר 24 h לאחר ציפוי (איור 3). הכאה סינכרונית של המונאולייר נצפתה ב 24-48 h. פיזור התאים ישפיע על צפיפות התרבות או אפילו מוביל לייבוש ולמוות תאים. מיקום התא מדויק ישירות על המערך הוא בעל חשיבות עליונה ולכן יש לתרגל את הטכניקה לציפוי אופטימלי. תא הדבקה האלקטרודה ההפניה יפריע ייצור אותות חשמליים. ראו איור 3 לתמונות מיקום מיטבי של CM, ותרבות לאחר 24 שעות. ה-CMs התרבותי על מרובת היטב אני נתון לבדיקת איכות עבור פעילות החשמל ב 48 h לאחר הציפוי. בדרך כלל, משרעת האות FP עולה מטווח μV ל-mV ב 4 ימים כ3. אם 50% מהאלקטרודות בתוך רשת ו-70% מהרשתות הכוללות אינן מפיקות אותות FP, הרשת או התרבות הם מיטביים והוא צריך להיות מושלך. רק תרבויות שעוברות את בדיקת האיכות מעובדות עבור ניתוח FP ו-AP. איור 6 מציג דוגמאות לאותות FP מסוג טוב ולתת סטנדרטי. אלקטרופורציה-הקלטות AP מתווכת ניתן להשיג מספר פעמים מתרבויות 48 h הציפוי פוסט-MEA. העסקת אלקטרופורציה, השגנו גישה תאיים להקליט ברזולוציה גבוהה APs ממערכות הקרדיוציט הנגזרות מרובות. פולסים במתח נמוך (1 V, 1 אלפיות, 1 Hz) עבור 30 s נמסרו עבור שינוי ארעי, הפיך של FP ל-AP. האלקטרופורציה מאפשרת גישה מוצלחת תאיים למדידה AP ב כ 75% של אלקטרודות. אותות חשמליים נרשמים עבור 2 דקות הכוללים 30 s טרום אלקטרופורציה, 30 s במהלך ו 1 מינימום פוסט אלקטרופורציה. רכבת של 10 s הצורות AP גל 10 של הפוסט-אלקטרופורציה מוערכים על פני כל האתרים עבור איכות וניתוח אותות. כל עקבות שאינם תואמים לאות AP טהורים יימחקו. כדי לחקור אם AP מגביר את הגישה לאות FP היינו מחשמלים את כל 288 האתרים כדי להקליט בו צורות גל. הנציג FP ואותות AP שנרשמו מאותו אתר תא משתי אלקטרודות שונות מוצגים באיור 11A. לא הבחנו בשום קשר בין הגברה ושינוי. המוני החשמל שנרשמו מאותו אתר סלולרי בנוסף, אלקטרופורציות מרובות של אותו אתר תא ב-0, 24, 48, 72 ו-96 h לא היתה השפעה משמעותית על צורת AP לאורך זמן (איור 11B). לאור התפוקה הגבוהה של המערכת, טכניקה ידנית כדי לחלץ ולכמת פרמטרים של עניין כגון מרווח RR, תדר מיידי והמשך פוטנציאלי הפעולה הדיפרנציאלי הוא לא יעיל זמן רב. מותאם אישית MATLAB סקריפט זמין לקהילת המחקר על פי בקשה מועסק לבצע מדידות צורת גל עם רזולוציה של 1 μs. נקודות זמן של אלקטרופורציה מצופים באות המחולצים כדי לזהות 10 s של נקודת הגישה לפוסט-אלקטרופורציה כדי לבצע חילוץ אותות, אבטחת איכות ופילוח של זרימת עבודה (איור 8, איור 9, איור 10). ממשק המשתמש מאפשר בחירה של הקטע הרצוי באמצעות מחווני האלקטרופורציה המצופים כמדריך. צורת הגל המחולקת מעובדת על-ידי תת-שגרות כדי לזהות עוד טופסי AP בודדים. הדבר מושלם באמצעות זיהוי שיא, שבו מזוהה המתח הגבוה והנמוך ביותר עבור כל מחזור. לאחר השלמת תהליך זה, הגברה מנורמלת, ודרכי השיוך של הזמן מוזלות להגדרת זמן אפס בערך שיא של 1. אינטרפולציה של נקודות חיתוך לאורך המחזורים הבודדים שימש לקביעת מדידות APD. לפיכך, תהליך אוטומציה חלקית עבור פילוח AP בצורת גל מאפשר ניתוח נתונים יעיל עבור פרמטרי APD שונים על פני אצוות מרובות של תרבויות בפרק זמן קצר. אוטומציה נוספת של קריטריוני הכללה והדרה עבור FPs ו APs מתמשך לניתוח נתונים בזמן אמת. יתרון משמעותי של הצלחת מרובת היטב היא שניתן להשתמש בה שוב מספר פעמים. שחזור זה מאפשר מחקרים אלקטרופיסיולוגיים חוזרים לאיסוף נתונים חסכוני ועקבי. הקלטות APs מאותו מערך לאחר 6 שחזורים מוצגים באיור 12. יחס אות לרעש דומה באמצעות שימוש חוזר מרובה. כדי להדגים את האמינות של המערך עבור מחקרים אלקטרולוגיים חוזרים, סך של 3815 התבניות AP גל ממאגר מתוך שלוש אצוות שחזור ונתוני המשך AP מופק כדי לבחון את החזרה של התוצאות. מגרשים הפצה ליחיד בצורת גל של APD30, apd80, טריאנגולציה (apd80— apd30) ו קיצור החלקי ((apd80— apd30)/(apd80)) מוצגים (איור 13). איור 1: ציפוי מקדים של הקפאה מקצועית להבשלה. (א) עיבוד תא עבור ציפוי מראש 1 בקבוקון של 10 ימים לאחר בידול Cryopreserved-CMs. (ב) בחדות שלב תמונות של מוצלחת (שמאל) ו מוצלח (מימין) תרבויות היפנוסי. סרגל קנה מידה: 275 μm. לראות וידאו 1 ו- video 2 לקבלת מוצלחת 14 ו -24 ימים לאחר בידול דוגמאות לתרבות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 2: התקנה והכנה רב ממדי בצלחת. (A) מרובת הצלחות מאה שרטוטים: הצלחת מורכב 24 בארות (A1 עד D6) כל המכיל 12 מערכים מיקרואלקטרודה ו 4 אלקטרודות היקפי התייחסות. אלקטרודה בקוטר: 30 יקרומטר/אינטר-אלקטרודה מרחק: 300 יקרומטר. ניתן לקבל הקלטות מ-288 אלקטרודות בו זמנית. (ב) מצעדי הטיפול בעיקור והידרופילית לפני ציפוי היפנוסק-ס מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 3: דיסוציאציה היפנוסי ס וציפוי בצלחת מרובת המאה. (א) שרטוט של שלבי הציפוי של היפסק-ס מ עבור כל באר. (ב) תמונה מיקרוסקופית הממחישות את המיקום הנכון של התאים droplet המכסה את כל 12 האלקטרודות מבלי להתפשט ל -4 אלקטרודות התייחסות. (ג) בניגוד הפאזה תמונות מיקרוסקופיים של מופת (שמאל) ו-אטען (מימין) היפרטינג ס מ על מאה ה 24 h לאחר ציפוי. סרגל קנה מידה = 275 μm. ראה וידאו 3 לדוגמה מוצלחת של הציפוי של MEA. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 4: תוכנת רכישה בעלת מסך מרובה. חיצים מציינים את המיקום של תכונות מפתח ופונקציות שאליהן מפנה הטקסט: האפשרות ‘ בקרת טמפרטורה ‘ (1) מאפשרת ניטור טמפרטורה בזמן אמת במהלך הניסוי. הוספה/הוצאה (2) כפתור לפתוח ולשחרר את לוחית Multiwell מאה. הגדרת הפונקציה ‘ זרימה ניסויית ‘ (3) מאפשרת למשתמש לקבוע את משך ההקלטה. הפונקציה הגדרת רכישת נתונים (4) מאפשרת למשתמש להגדיר את קצב הדגימה ואת הגדרות מסנן הרכישה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 5: היפנוסק-ס’ ‘ מ אלקטרופורציה ורכישת אותות . הכרטיסיה גירוי הגדרה מאפשרת למשתמש להגדיר את פרמטרי הדופק אלקטרופורגדירוג. הכרטיסיה ‘ אלקטרודות גירוי ‘ מאפשרת למשתמש לבחור את אלקטרודות האלקטרופורטינג. ניתן לבחור כל שילוב של 288 אלקטרודות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 6: בדיקת איכות של מולטיטוב אני לפעילות חשמלית. תוכנת רכישתמסך רב-ממדי המציגה חלונות נתונים גולמיים עם דוגמאות מייצגות של אותות אופטימליים (A) ותת-תקן (B). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 7: אותות FP ו-AP ממערך חדש ומשוחזר. שלבי הניקוי הרב המגמטיים (A). האות הבסיסית של המערך החדש מראה אות מינימלית ליחס הרעש (B) ואותות FP מציגים את פעילות החשמל של הרשת (C). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 8: פילוח נתונים וניתוח. מבט על החלון הראשי של GUI לניתוח צורת גל. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 9: מקטעי נתונים וניתוח. לחצן אתחל טפסי גל כדי לזהות ולחלץ טופסי גל של AP לפילוח ולהתחיל את העיבוד הראשוני על-ידי התקרבות ובחירה של אזור העניין הפוטנציאלי לפעולה. . עיגולים אדומים הם מחווני האלקטרופורציה אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 10: פילוח וניתוח של נתונים. פסגות (אדום ‘ x ‘) ושקתות (עיגולים צהובים) מזוהים עבור כל צורת גל וגישה מנורמלת מונחים על בדיקת איכות של צורות גל. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 11: התלות של משרעת AP באות FP עבור הקלטות מרובות מאותו אתר תא. משרעת FP בטווחי μv (a, בלוח השמאלי העליון) או בטווחי mV (a, הפאנל הימני העליון) הקליט משני אלקטרודות עצמאיות לייצר משרעת AP בטווח mV (A, לוחותשמאלוימין למטה) לא מראה מתאם בין הגברה FP המוני ו . מגביר את העקרונות של הפוסט-אלקטרופורה צורות ה-AP המנורמלות עבור כל הקלטה מופיעות כמוצג עבור כל הקלטה. אלקטרופורציות מרובות של אותו אתר תא ב -0 עד 96 h הפיק טפסים באיכות גבוהה AP גל המאפשר מעקב אחר ממברנה אלקטרודינמיקה (ב). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 12: הקלטות AP לאחר שש שחזורים. במקביל, מוצגים בו בו 10 שלאחר האלקטרופורציה של מנות ה-AP. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 13: היסטד של פרמטרי APD ממספר שחזורים. מגרשים הפצה ליחיד בצורת גל-a30 (א), apd80 (ב), טריאנגולציה (apd80— apd30) (C) וקיצור החלקי ((apd80— apd30)/(apd80)) (D) מוצגים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. קבצים משלימים. . וידאו 1-3 אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
Discussion
במהלך השנים, היישום של אני כבר מוגבל לביצוע מדידות FP של תאים מתרגש לחקור את התכונות האלקטרופיזיולוגיות שלהם36,37,38,39. רק קבוצות מעטים דיווחו על עקבות AP מתאים אלקטרוגניים באמצעות טכנולוגיה מותאמת אישית MEA18,29,30. עם זאת, גישות אלה לא נחקרו לגבי הקלטות חוזרות ונשנות מאותן הכנות. פיתחנו מתודולוגיה חדשנית ומדויקת ללמידה APs מאותו אתר סלולרי במשך ימים במספר רב של רשתות היפרsc-CM בו3. במחקר שפורסם שלנו, הפלטפורמה multiwell gold מיקרו-זהב היה מועסק כדי להפיק AP בצורת גל ספריות מקבוצות מרובות של תרבויות היפנוsc-CM עם דיוק גבוהה עם ברזולוציה הטמפורלית של 1 μs. הפרוטוקול המתואר כאן מסביר את הזריעה של היפרsc-CMs במערך לצורך פיתוח יעיל של רשתות CM בעלת תפוקה גבוהה להקלטות AP. מספר שלבים קריטיים בפרוטוקול הם: 1) הפקה של מספר רב של בעלי טוהר גבוהה של איכות CMs מבוקרת עבור בנקאות הקפאה, 2) מאוד קיימא לאחר ההפשרה CMs עבור ציפוי והתבגרות, 3) טיפול של הצלחת הגדול ביותר של מאה ס מ זריעה, 4) דיסוציאציה של התרבות ההיפחות ב -30 ימים לאחר בידול ל-MEA ציפוי, ו -5) שחזור של האני לשימוש חוזר מרובים.
חשוב לציין כי וריאציה אצווה-to-אצווה בידול היפנוסק עלול להשפיע על תוצאות נסיוניות. השיטה המונאולייר לבידול הייתה ממוטבת בתוך הבית לייצור ברמה גבוהה של התפוקה3,40. ניתוח FACS של MLC2v ו TNNT2 סמנים של התרבויות שלנו להפגין ≥ 90% חדרית-כמו פניטיפ3. התרבויות הללו מבוקרות באיכות. שמורות למחקרים ניסיוניים גישות בידול הנוכחי להניב שילוב הטרוגנית של nodal-, פרפור-וחדר כמו תאים3,16,17,41. לכן, אסטרטגיות המועסקים עבור מסוג CM האוכלוסייה העשרה יכול לשפר עוד יותר את הספציפיות של התרבויות. בנוסף, גישות הנדסת רקמות יכול להיות מועסק כדי לשפר את ההבשלה. השיטות המוצעות כאן יכולות להיות מיושמות בקלות עבור מקורות CM אחרים.
הטפסים AP גל שנרשמו באמצעות מאה היו דומים לאלה שנרשמו מרשתות של קרדיומיקוציטים על ידי מיפוי אופטי42,43, מוליכים למחצה משלימים תחמוצת המתכת מבוסס מאה18,21, ו-AP מדומה באמצעות הקלטות FP20. כדי לטפל במנגנון של מדידות AP באמצעות MEA חי ו ספירואה25 הפגינו כי ממשק אלקטרופור-אלקטרודה לחקות את טכניקת מיקרואלקטרודה חד זכוכית הוקמה. עם זאת, הפוטנציאל קרום מנוחה וערכי משרעת אמיתי במחקר שלנו לא ניתן להקים בהינתן כי ממשק אלקטרופור-אלקטרודה במערכות ה-MEA לא מכויל, וכי משרעת היא פונקציה של הרגישות והרזולוציה של טכניקה. הגישה שלנו משתפת מגבלות דומות מיפוי אופטי כשמדובר משרעת AP.
הקריאות המבוססות על בסיס מרובה מבוססות-AP שדווחו כאן פותחות אפשרויות חדשות להערכת בטיחות הסמים. למרות הספונטניות, מונאולאיירס האלה היכו בקצב קבוע. ניתוח פרמטרי APD ברשתות מרובות מספק תובנה על טרוגניות חשמליים (איור 13). עם זאת, מנתח הפיצויים APD מקיף חייב לכלול מרווחי זמן לפני הדיאסטולי. יתר על כן, טפסים באיכות גבוהה AP גל שנרשמו מאותו אתר תא מעל 96 h (איור 11B) הוא הדו הראשון לעקוב אחר אלקטרודינמיקה קרום לאורך זמן אשר יהיה ערך בפיתוח ובמחלות.
הפרוטוקול המתואר כאן כדי לכמת את פרמטרי AP ניתן להשתמש כדי ליצור עקומות במינון תגובה כדי לבדוק תרכובות. כפי שדווח לאחרונה על ידי אדוארדס et al.3, התגובה המינון של norepinephrine, איזופנול ו-E 4031 מותווים עבור apd בשלבים שונים רה-פולריזציה. המחקר שפורסם הראה את הדיוק והאמינות של הגישה לזיהוי שינויים עדינים התלויים במינון בטפסי גל AP בזמן אמת. טכניקה זו יכולה בקלות להיות מורחבת עבור תרכובות אחרות או ספריות מולקולה קטנות להבנת תגובות אלקטרופיסיולוגיים שונים.
הגישה המבוססת על ה-MEA למדידות AP שהוצגו במחקר זה, תהיה מעניינת לא רק לאלקטרו-מולוגים אלא גם לביולוגים תאים ומודלים בעלי סיליקו . יתר על כן, FP/AP הקלטות מאותו אתר תא ב-היסק-CMs תאפשר לחוקרים ליצור ספריות מידע קינטיות של מגוון רחב של רשתות סלולריות להתרגש בתוך פרק זמן קצר. הזמינות של משאבים אלה תהיה בעלת ערך עבור תגליות סמים ומידול מחלות.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
לא
Materials
| Accutase | Sigma Aldrich | A6964-100ML | cell dissociation solution |
| Acquisition software | Multichannel Systems | Multiwell-Screen v 1.9.2.0 | |
| B27 Supplement | ThermoFisher | 17504-044 | CM media supplement |
| Converter software | Multichannel Systems | MultiChannel DataManager | |
| DMEM/F12 | ThermoFisher | 11330-032 | |
| D-PBS | ThermoFisher | 14190-250 | |
| FBS | Fisher Scientific | SH3007103HI | |
| Fibronectin | Sigma Aldrich | F1141-5MG | |
| Geltrex | ThermoFisher | A1413202 | coating substrate |
| Interface board | Multichannel Systems | MCS-IFB 3.0 Multiboot Interface Board | |
| Multiwell MEA Plate | Multichannel Systems | 24W300/30G-288 | |
| RPMI 1640 | ThermoFisher | 11875-093 | CM base medium |
| Terg-a-zyme | Sigma Aldrich | Z273287-1EA | enzymatic detergent |
| Transfer pipettes, individually wrapped | Fisher Scientific | 1371148 | |
| Trypan Blue | Sigma Aldrich | T8154-100ML | |
| Ultrapure sterile water | ThermoFisher | 10977-023 | |
| 6-well tissue-culture treated plates | Fisher Scientific | 08-772-1B |
References
- Dambrot, C., Passier, R., Atsma, D., Mummery, C. L. Cardiomyocyte differentiation of pluripotent stem cells and their use as cardiac disease models. Biochemical Journal. 434 (1), 25-35 (2011).
- Dunn, K. K., Palecek, S. P. Engineering Scalable Manufacturing of High-Quality Stem Cell-Derived Cardiomyocytes for Cardiac Tissue Repair. Frontiers in medicine. 5, (2018).
- Edwards, S. L., et al. A Multiwell Cardiac muGMEA Platform for Action Potential Recordings from Human iPSC-Derived Cardiomyocyte Constructs. Stem Cell Reports. 11 (2), 522-536 (2018).
- Herron, T. J., Lee, P., Jalife, J. Optical imaging of voltage and calcium in cardiac cells & tissues. Circulation Research. 110 (4), 609-623 (2012).
- Huebsch, N., et al. Miniaturized iPS-Cell-Derived Cardiac Muscles for Physiologically Relevant Drug Response Analyses. Scientific Reports. 6, 24726 (2016).
- Lundy, S. D., Zhu, W. Z., Regnier, M., Laflamme, M. A. Structural and functional maturation of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Stem Cells and Development. 22 (14), 1991-2002 (2013).
- Ma, J., et al. High purity human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: electrophysiological properties of action potentials and ionic currents. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 301 (5), H2006-H2017 (2011).
- Sharma, A., et al. Use of human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes to assess drug cardiotoxicity. Nature Protocols. , (2018).
- Zhang, D., et al. Tissue-engineered cardiac patch for advanced functional maturation of human ESC-derived cardiomyocytes. Biomaterials. 34 (23), 5813-5820 (2013).
- Zhang, J., et al. Extracellular matrix promotes highly efficient cardiac differentiation of human pluripotent stem cells: the matrix sandwich method. Circulation Research. 111 (9), 1125-1136 (2012).
- Burridge, P. W., Holmstrom, A., Wu, J. C. Chemically Defined Culture and Cardiomyocyte Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells. Current Protocols in Human Genetics. 87, (2015).
- Burridge, P. W., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
- Burridge, P. W., Zambidis, E. T. Highly efficient directed differentiation of human induced pluripotent stem cells into cardiomyocytes. Methods in Molecular Biology. , 149-161 (2013).
- Laflamme, M. A., et al. Cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells in pro-survival factors enhance function of infarcted rat hearts. Nature Biotechnology. 25 (9), 1015-1024 (2007).
- Sharma, A., et al. Derivation of highly purified cardiomyocytes from human induced pluripotent stem cells using small molecule-modulated differentiation and subsequent glucose starvation. Journal of Visualized Experiments. (97), (2015).
- Bhattacharya, S., et al. High efficiency differentiation of human pluripotent stem cells to cardiomyocytes and characterization by flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (91), (2014).
- Zhang, J., et al. Functional cardiomyocytes derived from human induced pluripotent stem cells. Circulation Research. 104 (4), e30-e41 (2009).
- Jans, D., et al. Action potential-based MEA platform for in vitro screening of drug-induced cardiotoxicity using human iPSCs and rat neonatal myocytes. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 87, 48-52 (2017).
- Strauss, D. G., Blinova, K. Clinical Trials in a Dish. Trends in Pharmacological Science. 38 (1), 4-7 (2017).
- Tertoolen, L. G. J., Braam, S. R., van Meer, B. J., Passier, R., Mummery, C. L. Interpretation of field potentials measured on a multi electrode array in pharmacological toxicity screening on primary and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Biochemical and Biophysical Research Communications. 497 (4), 1135-1141 (2018).
- Braeken, D., et al. Open-cell recording of action potentials using active electrode arrays. Lab Chip. 12 (21), 4397-4402 (2012).
- Otsuji, T. G., et al. Progressive maturation in contracting cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells: Qualitative effects on electrophysiological responses to drugs. Stem Cell Research. 4 (3), 201-213 (2010).
- Shinozawa, T., Imahashi, K., Sawada, H., Furukawa, H., Takami, K. Determination of appropriate stage of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for drug screening and pharmacological evaluation in vitro. Journal of Biomolecular Screening. 17 (9), 1192-1203 (2012).
- Raphel, F., et al. Identification of Ion Currents Components Generating Field Potential Recorded in MEA From hiPSC-CM. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 65 (6), 1311-1319 (2018).
- Hai, A., Spira, M. E. On-chip electroporation, membrane repair dynamics and transient in-cell recordings by arrays of gold mushroom-shaped microelectrodes. Lab Chip. 12 (16), 2865-2873 (2012).
- Xie, C., Lin, Z., Hanson, L., Cui, Y., Cui, B. Intracellular recording of action potentials by nanopillar electroporation. Nature Nanotechnology. 7 (3), 185-190 (2012).
- Cohen, A., Shappir, J., Yitzchaik, S., Spira, M. E. Reversible transition of extracellular field potential recordings to intracellular recordings of action potentials generated by neurons grown on transistors. Biosensors and Bioelectronics. 23 (6), 811-819 (2008).
- Ojovan, S. M., et al. A feasibility study of multi-site,intracellular recordings from mammalian neurons by extracellular gold mushroom-shaped microelectrodes. Scientific Reports. 5, 14100 (2015).
- Shmoel, N., et al. Multisite electrophysiological recordings by self-assembled loose-patch-like junctions between cultured hippocampal neurons and mushroom-shaped microelectrodes. Scientific Reports. 6, 27110 (2016).
- Lin, Z. C., Xie, C., Osakada, Y., Cui, Y., Cui, B. Iridium oxide nanotube electrodes for sensitive and prolonged intracellular measurement of action potentials. Nature Communications. 5, 3206 (2014).
- Stett, A., Burkhardt, C., Weber, U., van Stiphout, P., Knott, T. CYTOCENTERING: a novel technique enabling automated cell-by-cell patch clamping with the CYTOPATCH chip. Receptors Channels. 9 (1), 59-66 (2003).
- Kanda, Y., Yamazaki, D., Osada, T., Yoshinaga, T., Sawada, K. Development of torsadogenic risk assessment using human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: Japan iPS Cardiac Safety Assessment (JiCSA) update. Journal of Pharmacological Sciences. 138 (4), 233-239 (2018).
- Yang, X., Papoian, T. Moving beyond the comprehensive in vitro proarrhythmia assay: Use of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes to assess contractile effects associated with drug-induced structural cardiotoxicity. Journal of Applied Toxicology. 38 (9), 1166-1176 (2018).
- Sala, L., Bellin, M., Mummery, C. L. Integrating cardiomyocytes from human pluripotent stem cells in safety pharmacology: has the time come. British Journal of Pharmacology. 174 (21), 3749-3765 (2017).
- Zlochiver, V., Edwards, S., Joshi-Mukherjee, R. Longitudinal Cardiotoxic Effect of Doxorubicin in a Multicellular Cardiac Model. Biophysical Journal. 116 (3), (2019).
- Del Alamo, J. C., et al. High throughput physiological screening of iPSC-derived cardiomyocytes for drug development. Biochimica et Biophysica Acta. 1863 (7 Pt B), 1717-1727 (2016).
- Clements, M. Multielectrode Array (MEA) Assay for Profiling Electrophysiological Drug Effects in Human Stem Cell-Derived Cardiomyocytes. Current Protocols in Toxicology. 68, 21-22 (2016).
- Navarrete, E. G., et al. Screening drug-induced arrhythmia [corrected] using human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes and low-impedance microelectrode arrays. Circulation. 128 (11 Suppl 1), S3-S13 (2013).
- Harris, K., et al. Comparison of electrophysiological data from human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes to functional preclinical safety assays. Toxicological Sciences. 134 (2), 412-426 (2013).
- Zlochiver, V., Edwards, S. L., Joshi-Mukherjee, R. Longitudinal Cardiotoxic Effect of Doxorubicin in a Multicellular Cardiac Model. Biophysical Journal. 116 (3), (2019).
- Waas, M., et al. Are These Cardiomyocytes? Protocol Development Reveals Impact of Sample Preparation on the Accuracy of Identifying Cardiomyocytes by Flow Cytometry. Stem Cell Reports. , (2019).
- Gorospe, G., et al. Automated grouping of action potentials of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 61 (9), 2389-2395 (2014).
- Zhu, W., Varga, Z., Silva, J. R. Molecular motions that shape the cardiac action potential: Insights from voltage clamp fluorometry. Progress in Biophysics & Molecular Biology. 120 (1-3), 3-17 (2016).
Citer Cet Article
Zlochiver, V., Kroboth, S. L., Beal, C. R., Cook, J. A., Joshi-Mukherjee, R. Human iPSC-Derived Cardiomyocyte Networks on Multiwell Micro-electrode Arrays for Recurrent Action Potential Recordings. J. Vis. Exp. (149), e59906, doi:10.3791/59906 (2019).