Analyse du contenu des gouttelettes lipidiques dans les levures de fission et les levures en herbe à l'aide du traitement automatisé de l'image
Summary
Ici, nous présentons une implémentation de MATLAB de la détection automatisée et de la description quantitative des gouttelettes de lipide dans les images de microscopie de fluorescence des cellules de fission et de levure en herbe.
Abstract
Le métabolisme des lipides et sa régulation sont d’intérêt pour les sciences de la vie de base et appliquées et la biotechnologie. À cet égard, diverses espèces de levures sont utilisées comme modèles dans la recherche métabolique lipidique ou pour la production industrielle de lipides. Les gouttelettes lipidiques sont des corps de stockage très dynamiques et leur contenu cellulaire représente une lecture pratique de l’état métabolique des lipides. La microscopie fluorescence est une méthode de choix pour l’analyse quantitative des gouttelettes lipidiques cellulaires, car elle repose sur un équipement largement disponible et permet l’analyse des gouttelettes lipidiques individuelles. En outre, l’analyse microscopique de l’image peut être automatisée, ce qui augmente considérablement le débit global de l’analyse. Ici, nous décrivons un flux de travail expérimental et analytique pour la détection automatisée et la description quantitative des gouttelettes lipidiques individuelles dans trois espèces différentes de levure modèle : les levures de fission Schizosaccharomyces pombe et Schizosaccharomyces japonicus, et la levure en herbe Saccharomyces cerevisiae. Les gouttelettes lipidiques sont visualisées avec BODIPY 493/503, et le dextran fluorescent à l’imperméabilité cellulaire est ajouté au support culturel pour aider à identifier les limites cellulaires. Les cellules sont soumises à une microscopie d’épifluorescence 3D dans des canaux verts et bleus et les images z-stack qui en résultent sont traitées automatiquement par un pipeline MATLAB. La procédure produit de riches données quantitatives sur la teneur en gouttelettes lipidiques cellulaires et les caractéristiques individuelles des gouttelettes lipidiques dans un format tabulaire adapté aux analyses en aval dans les principaux paquets de tabletur ou statistiques. Nous fournissons des analyses d’exemple de la teneur en gouttelettes lipidiques dans diverses conditions qui affectent le métabolisme des lipides cellulaires.
Introduction
Les lipides jouent un rôle crucial dans l’énergie cellulaire et le métabolisme du carbone, la synthèse des composants membranaires et la production de substances bioactives. Le métabolisme des lipides est affiné en fonction des conditions environnementales, de la disponibilité des nutriments et de la phase1du cycle cellulaire. Chez l’homme, le métabolisme des lipides a été relié à des maladies telles que l’obésité, le diabète de type II et le cancer2. Dans l’industrie, les lipides produits par les micro-organismes, comme les levures, représentent une source prometteuse de carburants diesel renouvelables3. Les cellules stockent les lipides neutres dans ce qu’on appelle les gouttelettes lipidiques (LD). Ces corps conservés de façon évolutive sont composés de triacylglycérols, d’esters de stéroyles, d’une monocouche phospholipide externe et de protéines associées1. Les LD proviennent du réticulum endoplasmique, exercent une dynamique du cycle cellulaire ou de la phase de croissance, et sont importants pour l’homéostasie lipidique cellulaire1. Le nombre De LD et la morphologie peuvent être utilisés comme un proxy commode en assérant le métabolisme de lipide dans diverses conditions de croissance ou en examinant un panneau de mutants. Compte tenu de leur nature dynamique, les techniques capables d’analyser les propriétés des LD individuels sont d’un intérêt particulier dans les études du métabolisme des lipides.
Diverses espèces de levures ont été utilisées pour décrire les voies métaboliques liées aux lipides et leur régulation, ou utilisées en biotechnologie pour produire des composés ou des carburants intéressants1. En outre, pour les levures modèles, telles que la levure en herbe Saccharomyces cerevisiae ou la levure de fission lointaine ment liée Schizosaccharomyces pombe, bibliothèques de souches de suppression à l’échelle du génome sont disponibles qui peuvent être utilisés pour le haut débit écrans4,5. Récemment la composition et la dynamique de LD ont été décrites dans S. pombe6,7,8,9, et les mutants liés au métabolisme de lipide ont été isolés dans la levure modèle émergente Schizosaccharomyces japonicus10.
De nombreuses techniques sont disponibles pour étudier le contenu et la dynamique LD. La plupart emploient une sorte de coloration de LD avec des colorants lipophiles tels que nile Red ou BODIPY 493/503. Ce dernier montre des spectres d’excitation et d’émission plus étroits, et une plus grande spécificité vers les lipides neutres (LD) par opposition aux phospholipides (membranes)11. Les méthodes fluormétriques et de flux-cytométrie ont été utilisées avec succès dans diverses espèces fongiques pour découvrir des gènes et des conditions de croissance qui affectent la teneur en lipides de stockage12,13,14,15. Bien que ces méthodes conviennent aux applications à haut débit, elles ne peuvent pas mesurer le nombre et la morphologie des LD individuels dans les cellules, qui peuvent différer considérablement entre les conditions de croissance et les génotypes. La diffusion cohérente de Raman ou la microscopie holographique numérique sont des méthodes sans étiquette qui produisent des données de niveau LD, mais exigent l’équipement coûteux spécialisé16,17,18. La microscopie fluorescence, d’autre part, peut fournir des données détaillées sur le contenu LD, tout en utilisant des instruments couramment disponibles et des outils logiciels d’analyse d’images. Plusieurs workflows d’analyse existent qui comportent divers degrés de sophistication et d’automatisation dans la détection de cellules/LD à partir des données d’image, et sont optimisés pour différents types de cellules, tels que les cellules métazoaires avec de grands LD19,20 , 21, ou levures en herbe17,22,23. Certaines de ces approches ne fonctionnent qu’en 2D (p. ex., sur des images de projection maximale), ce qui peut ne pas décrire de façon fiable le contenu LD cellulaire. À notre connaissance, aucun outil n’existe pour déterminer le contenu et la morphologie de LD à partir des données microscopiques de levure de fission. Le développement d’analyses automatisées et robustes au niveau de la LD apporterait une sensibilité accrue et une puissance statistique accrue, et fournirait des informations riches sur la teneur en lipides neutres, idéalement chez plusieurs espèces de levures.
Nous avons développé un flux de travail pour l’analyse du contenu LD à partir d’images de microscopie de fluorescence 3D de cellules de levure. Les cellules vivantes sont tachées de BODIPY 493/503 et de Dextran Cascade Blue pour visualiser les LD et déterminer les limites cellulaires, respectivement. Les cellules sont immobilisées sur des lames de verre et soumises à l’imagerie par la pile z à l’aide d’un microscope à épifluorescence standard. Les images sont ensuite traitées par un pipeline automatisé mis en œuvre dans MATLAB, un paquet (commercial) largement utilisé pour les analyses statistiques. Le pipeline effectue le prétraitement de l’image, la segmentation (cellules par rapport à l’arrière-plan, l’élimination des cellules mortes) et l’identification LD. Les données riches au niveau LD, telles que la taille du LD et l’intensité de la fluorescence, sont ensuite fournies dans un format tabulaire compatible avec les principaux outils logiciels de feuilles de calcul. Le flux de travail a été utilisé avec succès pour déterminer l’impact de la disponibilité des sources d’azote sur le métabolisme des lipides dans S. pombe24. Nous démontrons maintenant la fonctionnalité du flux de travail dans S. pombe, S. japonicus et S. cerevisiae, en utilisant des conditions de croissance ou des mutants qui affectent le contenu lD cellulaire.
Protocol
Representative Results
Discussion
La compréhension du métabolisme des lipides et de sa régulation est importante à la fois pour la biologie de base et pour les applications cliniques et biotechnologiques. Le contenu de LD représente une lecture commode de l’état de métabolisme de lipide de la cellule, avec la microscopie de fluorescence étant l’une des méthodes principales employées pour la détermination de contenu de LD. Le protocole présenté permet la détection automatisée et la description quantitative des LD individuels chez trois esp?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par les subventions de l’Université Charles PRIMUS/MED/26, GAUK 1308217 et SVV 260310. Nous remercions Ondôej Ebesta pour son aide dans le développement de la microscopie et le développement du pipeline d’analyse d’images. Nous remercions le laboratoire ReGenEx pour les souches De Cervisiae, et le laboratoire de JapoNet et Hironori Niki pour les souches de S. japonicus. La souche ppc1-88 a été fournie par The Yeast Genetic Resource Center Japan. La microscopie a été réalisée dans le Laboratoire de microscopie Confocal et Fluorescence cofinancé par le Fonds européen de développement régional et le budget de l’Etat de la République tchèque (Projet no. CZ.1.05/4.1.00/16.0347 et CZ.2.16/3.1.00/21515).
Materials
| 12-bit monochromatic CCD camera Hamamatsu ORCA C4742-80-12AG | Hamamatsu | or equivalent | |
| Adenine hemisulfate salt, ≥99% | Merck | A9126-25G | |
| BODIPY 493/503 (4,4-Difluoro-1,3,5,7,8-Pentamethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene) | Thermo Fisher Scientific | D3922 | for neutral lipid staining |
| D-(+) – Glucose, ≥99.5% | Merck | G7021 | |
| Dextran, Cascade Blue, 10,000 MW, Anionic, Lysine Fixable | Thermo Fisher Scientific | D1976 | for negative staining of cells |
| Dimethyl sulfoxide, ≥99.5% | Merck | D4540 | or higher purity, keep anhydrous on molecular sieves |
| EMM broth without dextrose | Formedium | PMD0405 | medium may also be prepared from individual components |
| Fiji/ImageJ software | NIH | or equivalent; for visual inspection of microscopic data | |
| High precision cover glasses, 22×22 mm, No 1.5 | VWR | 630-2186 | use any # 1.5 cover glass |
| Image Processing Toolbox for MATLAB, version 10.0 | Mathworks | ||
| Lectin from Glycine max (soybean) | Merck | L1395 | for cell immobilization on slides |
| MATLAB software, version 9.2 | Mathworks | ||
| Microscope slide, 26 x 76 mm, 1 mm thickness | Knittel Glass | L762601.2 | use any microscope slide fitting your microscope stage, clean thoroughly before loading cells |
| Olympus CellR microscope with automatic z-axis objective movement | Olympus | or equivalent | |
| pentaband filter set | Semrock | F66-985 | brightfield, green and blue channels are sufficient |
| Signal Processing Toolbox for MATLAB, version 7.4 | Mathworks | ||
| SP supplements | Formedium | PSU0101 | |
| standard office computer capable of running MATLAB | |||
| Statistics and Machine Learning Toolbox for MATLAB, version 11.1 | Mathworks | ||
| Universal peptone M66 for microbiology | Merck | 1070431000 | |
| UPLSAPO 60XO objective | Olympus | or equivalent | |
| Yeast extract | Formedium | YEA03 | |
| Yeast nitrogen base without amino acids | Formedium | CYN0405 |
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