تحليل محتوى قطرات الدهون في الانشطار والخمائر الناشئة باستخدام المعالجة الآلية للصور
Summary
هنا، نقدم تنفيذ MATLAB للكشف الآلي والوصف الكمي لقطرات الدهون في الصور المجهرية الفلورية من الانشطار وخلايا الخميرة الناشئة.
Abstract
التمثيل الغذائي للدهون وتنظيمها هي ذات أهمية لكل من علوم الحياة الأساسية والتطبيقية والتكنولوجيا الحيوية. في هذا الصدد، وتستخدم أنواع الخميرة المختلفة كنماذج في البحوث الأيضية الدهون أو لإنتاج الدهون الصناعية. قطرات الدهون هي هيئات تخزين ديناميكية للغاية ومحتواها الخلوي يمثل قراءة مريحة للدولة الأيضية الدهون. التنظير المجهري الفلوري هو طريقة مفضلة للتحليل الكمي لقطرات الدهون الخلوية، كما أنه يعتمد على المعدات المتاحة على نطاق واسع ويسمح بتحليل قطرات الدهون الفردية. وعلاوة على ذلك، يمكن أن يكون تحليل الصور المجهرية آلية، مما يزيد إلى حد كبير من الإنتاجية العامة للتحليل. هنا، ونحن نصف سير العمل التجريبية والتحليلية للكشف الآلي والوصف الكمي لقطرات الدهون الفردية في ثلاثة أنواع مختلفة من الخميرة النموذجية: الخمائر الانشطارية Schizosaccharomyces pombe و Schizosaccharomyces japonicus، والخميرة الناشئة Saccharomyces سيريفيسياي. يتم تصور قطرات الدهون مع BODIPY 493/503، ويتم إضافة dextran الفلورسنت غير قابل للنفاذ ية الخلية إلى وسائل الإعلام الثقافية للمساعدة في تحديد حدود الخلية. تخضع الخلايا للميكروسكوب الظهارة ثلاثية الأبعاد في القنوات الخضراء والزرقاء ويتم معالجة الصور z-stack الناتجة تلقائيًا بواسطة خط أنابيب MATLAB. وناتج هذا الإجراء بيانات كمية غنية عن محتوى قطرات الدهون الخلوية وخصائص قطرات الدهون الفردية في شكل جدولي مناسب للتحليلات النهائية في جداول البيانات الرئيسية أو الحزم الإحصائية. نحن نقدم أمثلة تحليلات لمحتوى قطرات الدهون في ظل ظروف مختلفة تؤثر على استقلاب الدهون الخلوية.
Introduction
تلعب الدهون أدوارًا حاسمة في الطاقة الخلوية والتمثيل الغذائي للكربون، وتوليف مكونات الغشاء، وإنتاج المواد النشطة بيولوجياً. يتم ضبط أيض الدهون بدقة وفقا للظروف البيئية، وتوافر المواد الغذائية والمرحلة1دورة الخلية. في البشر، وقد تم ربط التمثيل الغذائي للدهون إلى أمراض، مثل السمنة، والسكري من النوع الثاني والسرطان2. في الصناعة، والدهون التي تنتجها الكائنات الحية الدقيقة، مثل الخمائر، تمثل مصدرا واعدا من وقود الديزل المتجددة3. تخزن الخلايا الدهون المحايدة في ما يسمى قطرات الدهون (LDs). وتتألف هذه الهيئات المحفوظة تطوريا من triacylglycerols، استرات الستيرل، أحادية طبقة فوسفوليبيد الخارجي والبروتينات المرتبطةبها 1. تنشأ الـ LDs في الشبكية الإندوبلازمية، وتمارس دورة الخلايا أو ديناميات مرحلةالنمو، وهي مهمة للبطانة الدهنية 1. يمكن استخدام عدد LD ومورفولوجيا كوكيل مناسب عند اختبار استقلاب الدهون في ظل ظروف النمو المختلفة أو عند فحص لوحة من المتحولين. وبالنظر إلى طبيعتها الديناميكية، فإن التقنيات القادرة على تحليل خصائص الـ LDs الفردية لها أهمية خاصة في دراسات استقلاب الدهون.
وقد استخدمت أنواع الخميرة المختلفة لوصف مسارات التمثيل الغذائي المتعلقة بالدهون وتنظيمها، أو استخدامها في التكنولوجيا الحيوية لإنتاج مركبات مثيرة للاهتمام أو الوقود1. وعلاوة على ذلك، لنماذج الخمائر، مثل الخميرة الناشئة Saccharomyces سيريفيسياي أو الخميرة الانشطارية ذات الصلة البعيدة Schizosaccharomyces pombe، تتوفر مكتبات سلالة الحذف على نطاق الجينوم التي يمكن استخدامها لالإنتاجية العالية شاشات4,5. في الآونة الأخيرة تم وصف تكوين LD والديناميات في S. pombe6,7,8,9, وقد تم عزل المسوخ المتعلقة باستقلاب الدهون في الخميرة نموذج الناشئة شيزوساكاشارومايسيس جابونيكوس10.
تتوفر العديد من التقنيات لدراسة محتوى LD ودينامياتها. معظم توظيف نوع من تلطيخ اللادلس مع الأصباغ lipophilic مثل النيل الأحمر أو BODIPY 493/503. هذا الأخير يظهر الإثارة أكثر ضيقا والأطياف الانبعاثات، وزيادة خصوصية نحو الدهون المحايدة (LDs) بدلا من فوسفوليبيدات (الأغشية)11. وقد استخدمت أساليب قياس الفلورومتري والتدفق والقياس في الخلايا بنجاح في مختلف الأنواع الفطرية للكشف عن الجينات وظروف النمو التي تؤثر على محتوى الدهون التخزين12،13،14،15. في حين أن هذه الأساليب مناسبة للتطبيقات عالية الإنتاجية، فإنها لا يمكن قياس أعداد ومورفولوجيا LDs الفردية في الخلايا، والتي يمكن أن تختلف بشكل كبير بين ظروف النمو والأنماط الجينية. التشتت المتماسك رامان أو المجهرية الثلاثية الأبعاد الرقمية هي أساليب خالية من التسميات التي تنتج البيانات على مستوى LD، ولكن تتطلب معدات متخصصة مكلفة16،17،18. ومن ناحية أخرى، يمكن أن توفر التنظير المجهري الفلوري بيانات مفصلة عن محتوى الـ LD، مع استخدام الأدوات المتاحة عادة وأدوات برامج تحليل الصور. توجد العديد من مهام سير العمل التحليل التي تتميز بدرجات مختلفة من التطور والأتمتة في الكشف عن الخلايا /LD من بيانات الصورة، ويتم تحسينها لأنواع الخلايا المختلفة، مثل الخلايا الميتازوانية مع LDs كبيرة19،20 , 21، أو الخمائر الناشئة17،22،23. بعض هذه النهج تعمل فقط في 2D (على سبيل المثال، على صور الإسقاط القصوى)، والتي قد تفشل في وصف موثوق محتوى LD الخلوية. على حد علمنا، لا توجد أدوات لتحديد محتوى LD ومورفولوجيا من البيانات المجهرية الخميرة الانشطارية. ومن شأن وضع تحليلات آلية وقوية على مستوى الـ LD أن يجلب حساسية متزايدة وقوة إحصائية معززة، وأن يوفر معلومات غنية عن المحتوى المحايد للدهون، من الناحية المثالية في أنواع الخميرة المتعددة.
لقد قمنا بتطوير سير عمل لتحليل محتوى LD من الصور المجهرية الفلورية ثلاثية الأبعاد لخلايا الخميرة. الخلايا الحية ملطخة بـ BODIPY 493/503 وCascade Blue dextran لتصور LDs وتحديد حدود الخلايا، على التوالي. يتم تعطيل الخلايا على الشرائح الزجاجية وتخضع لتصوير z-stack باستخدام مجهر اللافلورية القياسية. ثم تتم معالجة الصور بواسطة خط أنابيب آلي يتم تنفيذه في MATLAB، وهي مجموعة (تجارية) تستخدم على نطاق واسع للتحليلات الإحصائية. يقوم خط الأنابيب بإجراء المعالجة المسبقة للصور، والتجزئة (الخلايا مقابل الخلفية، وإزالة الخلايا الميتة)، وتحديد LD. ثم يتم توفير البيانات الغنية على مستوى LD، مثل حجم LD وكثافة الفلورة، في شكل جدول يتوافق مع أدوات برامج جداول البيانات الرئيسية. تم استخدام سير العمل بنجاح لتحديد تأثير توافر مصدر النيتروجين على استقلاب الدهون في S. pombe24. نحن الآن تبين وظيفة سير العمل في S. pombe, S. japonicus و S. cerevisiae, باستخدام ظروف النمو أو المتحولين التي تؤثر على محتوى LD الخلوية.
Protocol
Representative Results
Discussion
فهم التمثيل الغذائي للدهون وتنظيمها مهم لكل من البيولوجيا الأساسية، والتطبيقات السريرية والتكنولوجية الحيوية. يمثل محتوى LD قراءة مريحة لحالة استقلاب الدهون في الخلية، مع الفحص المجهري الفلوري كونها واحدة من الطرق الرئيسية المستخدمة لتحديد محتوى LD. يسمح البروتوكول المعروض بالكشف الآلي …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم دعم هذا العمل من قبل جامعة تشارلز المنح PRIMUS/MED/26، GAUK 1308217 و SVV 260310. نشكر Ondřej Šebesta على المساعدة في الفحص المجهري وتطوير خط أنابيب تحليل الصور. نشكر مختبر ReGenEx لسلالات S. سيريفيسياي، ومختبر JapoNet وHironori Niki لسلالات S. japonicus. تم توفير سلالة PPC1-88 من قبل مركز الخميرة للموارد الوراثية في اليابان. وأُجري الفحص المجهري في مختبر الفحص المجهري للبؤرة والفلورة الذي يشترك في تمويله الصندوق الأوروبي للتنمية الإقليمية وميزانية الدولة للجمهورية التشيكية (المشروع رقم. CZ.1.05/4.1.00/16.0347 و CZ.2.16/3.1.00/21515).
Materials
| 12-bit monochromatic CCD camera Hamamatsu ORCA C4742-80-12AG | Hamamatsu | or equivalent | |
| Adenine hemisulfate salt, ≥99% | Merck | A9126-25G | |
| BODIPY 493/503 (4,4-Difluoro-1,3,5,7,8-Pentamethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene) | Thermo Fisher Scientific | D3922 | for neutral lipid staining |
| D-(+) – Glucose, ≥99.5% | Merck | G7021 | |
| Dextran, Cascade Blue, 10,000 MW, Anionic, Lysine Fixable | Thermo Fisher Scientific | D1976 | for negative staining of cells |
| Dimethyl sulfoxide, ≥99.5% | Merck | D4540 | or higher purity, keep anhydrous on molecular sieves |
| EMM broth without dextrose | Formedium | PMD0405 | medium may also be prepared from individual components |
| Fiji/ImageJ software | NIH | or equivalent; for visual inspection of microscopic data | |
| High precision cover glasses, 22×22 mm, No 1.5 | VWR | 630-2186 | use any # 1.5 cover glass |
| Image Processing Toolbox for MATLAB, version 10.0 | Mathworks | ||
| Lectin from Glycine max (soybean) | Merck | L1395 | for cell immobilization on slides |
| MATLAB software, version 9.2 | Mathworks | ||
| Microscope slide, 26 x 76 mm, 1 mm thickness | Knittel Glass | L762601.2 | use any microscope slide fitting your microscope stage, clean thoroughly before loading cells |
| Olympus CellR microscope with automatic z-axis objective movement | Olympus | or equivalent | |
| pentaband filter set | Semrock | F66-985 | brightfield, green and blue channels are sufficient |
| Signal Processing Toolbox for MATLAB, version 7.4 | Mathworks | ||
| SP supplements | Formedium | PSU0101 | |
| standard office computer capable of running MATLAB | |||
| Statistics and Machine Learning Toolbox for MATLAB, version 11.1 | Mathworks | ||
| Universal peptone M66 for microbiology | Merck | 1070431000 | |
| UPLSAPO 60XO objective | Olympus | or equivalent | |
| Yeast extract | Formedium | YEA03 | |
| Yeast nitrogen base without amino acids | Formedium | CYN0405 |
References
- Koch, B., Schmidt, C., Daum, G. Storage lipids of yeasts: a survey of nonpolar lipid metabolism in Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, and Yarrowia lipolytica. FEMS Microbiology Reviews. 38 (5), 892-915 (2014).
- Krahmer, N., Farese, R. V., Walther, T. C. Balancing the fat: lipid droplets and human disease. EMBO Molecular Medicine. 5 (7), 973-983 (2013).
- Lazar, Z., Liu, N., Stephanopoulos, G. Holistic Approaches in Lipid Production by Yarrowia lipolytica. Trends in Biotechnology. 36 (11), 1157-1170 (2018).
- Kim, D. U., et al. Analysis of a genome-wide set of gene deletions in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe. Nature Biotechnology. 28 (6), 1628-1629 (2010).
- Giaever, G., Nislow, C. The yeast deletion collection: a decade of functional genomics. Génétique. 197 (2), 451-465 (2014).
- Meyers, A., et al. The protein and neutral lipid composition of lipid droplets isolated from the fission yeast, Schizosaccharomyces pombe. Journal of Microbiology (Seoul, Korea). 55 (2), 112-122 (2017).
- Meyers, A., et al. Lipid Droplets Form from Distinct Regions of the Cell in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe. Traffic (Copenhagen, Denmark). 17 (6), 657-659 (2016).
- Long, A. P., et al. Lipid droplet de novo formation and fission are linked to the cell cycle in fission yeast. Traffic (Copenhagen, Denmark). 13 (5), 705-714 (2012).
- Yang, H. J., Osakada, H., Kojidani, T., Haraguchi, T., Hiraoka, Y. Lipid droplet dynamics during Schizosaccharomyces pombe sporulation and their role in spore survival. Biology Open. , 8 (2016).
- Aoki, K., Shiwa, Y., Takada, H., Yoshikawa, H., Niki, H. Regulation of nuclear envelope dynamics via APC/C is necessary for the progression of semi-open mitosis in Schizosaccharomyces japonicus. Genes To Cells: Devoted To Molecular & Cellular Mechanisms. 18 (9), 733-752 (2013).
- Karolin, J., Johansson, L. B. A., Strandberg, L., Ny, T. Fluorescence and Absorption Spectroscopic Properties of Dipyrrometheneboron Difluoride (BODIPY) Derivatives in Liquids, Lipid Membranes, and Proteins. Journal of the American Chemical Society. 116 (17), 7801-7806 (1994).
- Bozaquel-Morais, B. L., Madeira, J. B., Maya-Monteiro, C. M., Masuda, C. A., Montero-Lomeli, M. A new fluorescence-based method identifies protein phosphatases regulating lipid droplet metabolism. PloS One. 5 (10), e13692 (2010).
- Sitepu, I. R., et al. An improved high-throughput Nile red fluorescence assay for estimating intracellular lipids in a variety of yeast species. Journal of Microbiological Methods. 91 (2), 321-328 (2012).
- Rostron, K. A., Lawrence, C. L. Nile Red Staining of Neutral Lipids in Yeast. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1560, 219-229 (2017).
- Romero-Aguilar, L., Montero-Lomeli, M., Pardo, J. P., Guerra-Sánchez, G. Lipid Index Determination by Liquid Fluorescence Recovery in the Fungal Pathogen Ustilago Maydis. Journal of Visualized Experiments. (134), 1-6 (2018).
- Gupta, A., Dorlhiac, G. F., Streets, A. M. Quantitative imaging of lipid droplets in single cells. The Analyst. , (2018).
- Wolinski, H., Bredies, K., Kohlwein, S. D. Quantitative imaging of lipid metabolism in yeast: from 4D analysis to high content screens of mutant libraries. Methods in Cell Biology. , 108-365 (2012).
- Campos, V., Rappaz, B., Kuttler, F., Turcatti, G., Naveiras, O. High-throughput, nonperturbing quantification of lipid droplets with digital holographic microscopy. Journal of Lipid Research. 59 (7), 1301-1310 (2018).
- Ranall, M. V., Gabrielli, B. G., Gonda, T. J. High-content imaging of neutral lipid droplets with 1,6-diphenylhexatriene. BioTechniques. 51 (1), 35-42 (2011).
- Schnitzler, J. G., et al. Nile Red Quantifier: a novel and quantitative tool to study lipid accumulation in patient-derived circulating monocytes using confocal microscopy. Journal of Lipid Research. 58 (11), 2210-2219 (2017).
- Bombrun, M., Gao, H., Ranefall, P., Mejhert, N., Arner, P., Wählby, C. Quantitative high-content/high-throughput microscopy analysis of lipid droplets in subject-specific adipogenesis models. Cytometry. Part A the journal of the International Society for Analytical Cytology. 91 (11), 1068-1077 (2017).
- Capus, A., Monnerat, M., Ribeiro, L. C., de Souza, W., Martins, J. L., Sant’Anna, C. Application of high-content image analysis for quantitatively estimating lipid accumulation in oleaginous yeasts with potential for use in biodiesel production. Bioresource Technology. 203, 309-317 (2016).
- Lv, X., et al. Identification of gene products that control lipid droplet size in yeast using a high-throughput quantitative image analysis. Biochimica et biophysica acta. Molecular and Cell Biology Of Lipids. 1864 (2), 113-127 (2018).
- Zach, R., Tvarůžková, J., Schätz, M., Ťupa, O., Grallert, B., Převorovský, M. Mitotic defects in fission yeast lipid metabolism “cut” mutants are suppressed by ammonium chloride. FEMS Yeast Research. 18 (6), 1-7 (2018).
- Petersen, J., Russell, P. Growth and the Environment of Schizosaccharomyces pombe. Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (3), (2016).
- Aoki, K., Furuya, K., Niki, H. Schizosaccharomyces japonicus: A Distinct Dimorphic Yeast among the Fission Yeasts. Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2017).
- Curran, B. P. G., Bugeja, V. Basic investigations in Saccharomyces cerevisiae. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). , 1-14 (2014).
- Sabatinos, S. A., Forsburg, S. L. Molecular genetics of Schizosaccharomyces pombe. Methods in Enzymology. 470 (10), 759-795 (2010).
- Schindelin, J., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Eliceiri, K. W. The ImageJ ecosystem: An open platform for biomedical image analysis. Molecular Reproduction and Development. 82 (7-8), 518-529 (2015).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Nakamura, T., Pluskal, T., Nakaseko, Y., Yanagida, M. Impaired coenzyme A synthesis in fission yeast causes defective mitosis, quiescence-exit failure, histone hypoacetylation and fragile DNA. Open Biology. 2 (9), 120117 (2012).
- Furuya, K., Niki, H. Isolation of heterothallic haploid and auxotrophic mutants of Schizosaccharomyces japonicus. Yeast. 26 (4), 221-233 (2009).
- Ivnitski-Steele, I., et al. Identification of Nile red as a fluorescent substrate of the Candida albicans ATP-binding cassette transporters Cdr1p and Cdr2p and the major facilitator superfamily transporter Mdr1p. Analytical Biochemistry. 394 (1), 87-91 (2009).
- Wolinski, H., Kohlwein, S. D. Microscopic analysis of lipid droplet metabolism and dynamics in yeast. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 457 (1), 151-163 (2008).
- Graml, V., et al. A genomic Multiprocess survey of machineries that control and link cell shape, microtubule organization, and cell-cycle progression. Developmental Cell. 31 (2), 227-239 (2014).
