高产细胞外囊泡制剂的纯化远离病毒

研究围绕细胞外囊泡 （EV）， 特别是外显体， 一种 EV 范围 30-120 nm ， 其特点是存在三个四边形标记 CD81， CD9 和 CD63， 在很大程度上已经形成的方法， 分离和净化感兴趣的囊泡。解剖多层面机制的能力受到阻碍，因为复杂的和耗时的技术，生成样本组成由异质的囊泡群产生，通过不同的途径产生，内容广泛，大小，和密度。虽然这是几乎所有EV研究的问题，但在在病毒感染环境中研究EV时，它特别重要，因为病毒和病毒样颗粒（VLP）的直径可以与感兴趣的囊泡相似。例如，人类免疫缺陷病毒类型1（HIV-1）的直径约为100纳米，与许多类型的EV大致相同。因此，我们设计了一种新的 EV 隔离工作流来解决这些问题。

目前EV隔离的黄金标准是超离心。该技术利用各种囊泡密度，允许囊泡分离离心与差异沉积的高密度粒子与低密度粒子在每个^{阶段1，2。}需要几个低速离心步骤来去除完整的细胞（300-400 x g 10 分钟）、细胞碎片（±2，000 x g 10 分钟）和凋亡体/大囊泡（10 分钟=10，000 x g）。这些初始纯化后，高速超离心（100，000-2000，000 x g，1.5-2 小时）到沉积物EV。 执行洗涤步骤以进一步确保 EV 纯度，但是，这会导致隔离 EV 的数量减少，从而降低总产量^3，4。此方法的效用进一步受到需要大量单元（约 1 x 10^8）和大样本体积 （> 100 mL） 以达到足够的结果的限制。

为了解决人们日益关注的问题，近年来，用亲水性聚合物沉淀囊泡已成为一种有用的技术。聚乙烯乙二醇 （PEG） 或其他相关的沉淀试剂允许用户通过使用选择的试剂孵育样品，然后以单个低速孵育样品，提取样品中的囊泡、病毒和蛋白质或蛋白质-RNA聚合体离心^1，2，5。我们以前曾报道过，使用PEG或相关方法沉淀EV与传统超离心相比，可产生更高的^产量6。此策略快速、简单，不需要额外的昂贵设备，易于扩展，并保留了 EV 结构。然而，由于这种方法的混杂性，所得样品含有多种产品，包括游自由蛋白、蛋白质复合物、一系列EV和病毒，因此需要进一步纯化才能获得所需的^{种群1。 ，2，7，8}.

为了克服从各种沉淀方法中获得的EV的异质性，利用密度梯度超离心（DG）来更好地根据粒子的密度分离粒子。此方法使用密度梯度介质（如碘醇或蔗糖）进行逐步梯度，允许将 EV 与蛋白质、蛋白质复合体以及病毒或病毒样颗粒 （VLP） 分离。需要注意的是，虽然人们曾经认为DG允许更精确地分离EV亚群，但现在人们知道，各种囊泡的大小和密度可以重叠。例如，已知外体具有1.08-1.22 g/mL⁹的浮选密度，而从Golgi（COPI⁺或克拉林^*）分离的囊泡的密度为1.05-1.12 g/mL，而来自内质的色囊密度（COPII⁼） 沉积物在 1.18-1.25 g/mL^{1，2，3，4，9}.此外，如果希望将外索分数与含有病毒颗粒的馏分进行比较，这可能变得更加困难，具体取决于感兴趣的病毒的密度 – 除了HIV-1之外，还有其他病毒可能同时均衡密度作为外体正^分数2。

最后，富集用于下游可视化和功能测定的EV制备对EV研究至关重要。使用EV富集纳米颗粒，特别是直径为700-800nm的多功能水凝胶颗粒，是实现集中式EV制备的关键步骤。它们具有高亲和力芳香诱饵，由多孔外筛壳封装，以促进选择性。本研究中使用的纳米粒子包括两种不同核心诱饵的显性制剂（反应红120 NT80;和Cibacron蓝色F3GA NT82），它们表明可以增加从各种试剂和生物流体中捕获EV（参见材料表））^{6，10，11，12，13，14，15}。这些颗粒从多种起始材料（包括碘化醇馏分、细胞培养上清液以及患者生物流体（如血浆、血清、脑脊髓液 （CSF）和尿液^6、13）中轻松浓缩 EV.

本文介绍的方法结合多种技术，提高了现有EV纯化技术的效率;EV 沉淀、密度梯度超离心和颗粒捕获，可简化工作流程、降低样品要求并提高产量，以获得更均匀的 EV 样本，用于所有 EV 研究。该方法在病毒感染期间对EV及其含量的调查特别有用，因为它包括0.22 μm过滤步骤，以排除大、不需要的囊泡和VLP，并根据密度分离总EV人群，以有效将 EV 与病毒隔离开来。