Imaging intravitale dei linfociti intraettali a Murine Small Intestine
Summary
Descriviamo un metodo per visualizzare gli IEL con etichettatura GFP utilizzando l’imaging intravitale dell’intestino piccolo murino mediante microscopia confocale del disco rotante invertita. Questa tecnica consente il monitoraggio delle cellule vive all’interno della mucosa fino a 4 h e può essere utilizzata per studiare una varietà di interazioni immuno-epiteliali intestinali.
Abstract
I linfociti intraeliali che esprimono il recettore delle cellule T (IEL) svolgono un ruolo chiave nella sorveglianza immunitaria dell’epitelio intestinale. A causa in parte della mancanza di un ligando definitivo per il recettore delle cellule T, la nostra comprensione della regolazione dell’attivazione di IEL e della loro funzione in vivo rimane limitata. Ciò richiede lo sviluppo di strategie alternative per interrogare i percorsi di segnalazione coinvolti nella regolazione della funzione IEL e la reattività di queste cellule al microambiente locale. Anche se gli IEL sono ampiamente compresi per limitare la traslocazione degli agenti patogeni, l’uso dell’imaging intravitale è stato fondamentale per comprendere le dinamiche spatiotemporali delle interazioni IEL/epiteliali a stato costante e in risposta a patogeni invasivi. Qui, presentiamo un protocollo per la visualizzazione del comportamento migratorio IEL nella piccola mucosa intestinale di un topo reporter del cellulare T GFP utilizzando la microscopia laser confocale del disco rotante invertita. Sebbene la profondità massima di imaging di questo approccio sia limitata rispetto all’uso della microscopia a scansione laser a due fotoni, la microscopia laser confocale a disco rotante offre il vantaggio dell’acquisizione di immagini ad alta velocità con fotobleaching ridotto e Photodamage. Utilizzando il software di analisi delle immagini 4D, il comportamento di sorveglianza delle cellule T e le loro interazioni con le cellule vicine possono essere analizzati in seguito alla manipolazione sperimentale per fornire ulteriori informazioni sull’attivazione e il funzionamento dell’IEL all’interno della mucosa intestinale.
Introduction
I linfociti intraeliali (IEL) si trovano all’interno dell’epitelio intestinale e si trovano sia lungo la membrana del seminterrato che tra celle epiteliali adiacenti nello spazio intercellulare laterale1. C’è circa un IEL per ogni 5-10 cellule epiteliali; questi IEL servono come sentinelle per fornire la sorveglianza immunitaria della grande distesa della barriera epiteliale intestinale2. Gli IEL che esprimono il recettore delle cellule T (TCR) costituiscono fino al 60% della popolazione totale di IEL nell’intestino piccolo murno. Studi condotti su topi carenti di cellule T dimostrano un ruolo in gran parte protettivo di queste cellule in risposta a lesioni intestinali, infiammazione e infezione3,4,5. Nonostante la generazione del topo a eliminazione diretta Tcrd 6, la nostra comprensione della biologia della IEL rimane limitata in parte a causa del fatto che i ligandi riconosciuti da z – il TCR sono ancora da identificare7 . Di conseguenza, la mancanza di strumenti per studiare questa popolazione cellulare ha reso difficile studiare il ruolo dell’attivazione e della funzione della TCR in condizioni fisiologiche e patologiche. Per colmare questa lacuna, abbiamo sviluppato tecniche di imaging dal vivo per visualizzare il comportamento migratorio di IEL e le interazioni con gli enterociti vicini come mezzo per fornire ulteriori informazioni sulla funzione IEL e sulla reattività agli stimoli esterni in vivo.
Nell’ultimo decennio, l’imaging intravitale ha ampliato significativamente la nostra comprensione degli eventi molecolari coinvolti in molteplici sfaccettature della biologia intestinale, tra cui lo spargimento delle cellule epiteliali8, regolazione della funzione di barriera epiteliale9 ,10, campionamento di cellule mieloidi del contenuto luminale11,12e interazioni host-microbe11,13,14,15,16 . Nel contesto della biologia IEL, l’uso della microscopia intravitale ha fatto luce sulle dinamiche spatiotemporali della motilità IEL e sui fattori che mediano il loro comportamento di sorveglianza13,14,15, 16. Lo sviluppo del topo reporter TcrdH2BeGFP (TcrdEGFP), che etichetta gli IEL con l’espressione nucleare della GFP17, ha rivelato che gli IEL sono altamente motili all’interno dell’epitelio e presentano un comportamento di sorveglianza unico che risponde al microbico infezione17,13,14. Recentemente, è stato sviluppato un altro topo di reporter delle cellule T (Tcrd-GDL) che esprime GFP nel citoplasma per consentire la visualizzazione dell’intera cellula18. Metodologia simile è stata utilizzata per studiare il requisito di recettori chemiochine specifici, come il recettore accoppiato a proteina G (GPCR)-18 e -55, sulla dinamica della motilità IEL19,20. In assenza di un reporter specifico per le cellule, sono stati utilizzati anticorpi coniugati fluorescenti contro CD8, per visualizzare e tracciare la motilità IEL in vivo19,20. Sebbene la microscopia a scansione laser a due fotoni sia comunemente utilizzata per l’imaging intravitale, l’uso della microscopia laser confocale confocale a disco rotante offre vantaggi unici per catturare immagini multicanale ad alta velocità e ad alta risoluzione con un minimo rumore di fondo. Questa tecnologia è ideale per chiarire le dinamiche spatiotemporali delle interazioni immuno/epiteliali all’interno del complesso microambiente della mucosa intestinale. Inoltre, attraverso l’uso di vari modelli murini transgenici e/o ad eliminazione diretta, questi studi possono fornire informazioni sulla regolazione molecolare della funzione immunitaria e/o delle cellule epiteliali intestinali.
Protocol
Representative Results
Discussion
Lo sviluppo di tecniche di microscopia intravitale ha fornito un’opportunità senza precedenti per osservare la riorganizzazione delle strutture subcellulari8,9,22, interazioni cellule-cellule12, 25 e comportamento migratorio cellulare13,14,15,16</s…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è supportato da NIH R21 AI143892, New Jersey Health Foundation Grant, Busch Biomedical Grant (KLE). Ringraziamo Madeleine Hu per la sua assistenza nella modifica del manoscritto e nella fornitura dei dati riportati nei risultati rappresentativi.
Materials
| 35mm dish, No. 1.5 Coverslip | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
| Alexa Fluor 633 Hydrazide | Invitrogen | A30634 | |
| BD PrecisionGlide Hypodermic needles – 27g | Thermo Fisher Scientific | 14-826-48 | |
| BD Slip Tip Sterile Syringe – 1 ml | Thermo Fisher Scientific | 14-823-434 | |
| BD Tuberculin Syringe | Thermo Fisher Scientific | 14-829-9 | |
| Dissecting scissors | Thermo Fisher Scientific | 08-940 | |
| Electrocautery | Thermo Fisher Scientific | 50822501 | |
| Enclosed incubation chamber | OKOLAB | Microscope | |
| Eye Needles, Size #3; 1/2 Circle, Taper Point, 12 mm Chord Length | Roboz | RS-7983-3 | |
| Hank's Balanced Salt Solution | Sigma-Aldrich | 55037C | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | |
| Imaris (v. 9.2.1) with Start, Track, XT modules | Bitplane | Software | |
| Inverted DMi8 | Leica | Microscope | |
| IQ3 (v. 3.6.3) | Andor | Software | |
| Ketamine | Putney | Anesthesia | |
| Kimwipes | VWR | 21905-026 | |
| McPherson-Vannas scissors 3” (7.5 cm) Long 5X0.15mm Straight Sharp | Roboz | RS-5600 | |
| Non-absorbable surgical suture, Silk Spool, Black Braided | Fisher Scientific | NC0798934 | |
| Nugent Forceps 4.25” (11 cm) Long Angled Smooth 1.2mm Tip | Roboz | RS-5228 | |
| Puralube Vet Ointment | Dechra | Lubricating Eye Ointment | |
| Spinning disk Yokogawa CSU-W1 with a 63x 1.3 N.A. HC PLAN APO glycerol immersion objective, iXon Life 888 EMCCD camera, 405 nm diode laser, 488 nm DPSS laser, 640 nm diode laser | Andor | Confocal system | |
| Xylazine | Akorn | Anesthesia |
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