Прямой ген knock-out аксолотла спинного мозга нейронных стволовых клеток через Электропорации CAS9 Белковые-gRNA комплексов
Summary
Представлено здесь протокол для выполнения времени и пространства ограниченного гена нокаут в аксолотль спинного мозга путем введения CAS9-gRNA комплекса в спинной мозг центрального канала с последующим электропорированием.
Abstract
Аксолотль обладает уникальной способностью полностью регенерировать спинной мозг. Это в значительной степени из-за эпендимальных клеток, оставшихся в качестве нервных стволовых клеток (НСК) на протяжении всей жизни, которые распространяются на реформу эпендимальной трубки и дифференцироваться в потерянные нейроны после травмы спинного мозга. Расшифровка, как эти NSCs сохранить плюрипотентность после развития и размножаться на повреждение спинного мозга для реформирования точной структуры до травмы может обеспечить ценную информацию о том, как млекопитающих спинного мозга может регенерировать, а также потенциальные варианты лечения. Выполнение генных нокаутов в конкретных подмножествах НСК в течение ограниченного периода времени позволит изучать молекулярные механизмы, стоящие за этими регенеративными процессами, не будучи сбит с толку эффектами, возмущающимися развитием. Описано здесь метод для выполнения гена нокаут в аксолоттный спинной мозг NSCs с помощью системы CRISPR-Cas9. Путем впрыскивать комплекс CAS9-gRNA в центральный канал спинного мозга последованного за электропорированием, гены цели постучаны вне в NSCs внутри специфически зоны спинного мозга на познаваемое timepoint, позволяющ для молекулярных изучений NSCs спинного мозга во время Регенерации.
Introduction
Спинной мозг большинства позвоночных не может регенерировать после травмы, что приводит к постоянной инвалидности. Некоторые саламандры, такие как аксолотль, являются заметными исключениями. Аксолотл может полностью регенерировать структурно идентичный спинной мозг и полностью восстановить функцию спинного мозга. Большая часть регенеративной способности аксолотов огорожения обусловлена эпендимальными клетками. Эти клетки выстраивались в линию центрального канала, и в отличие от клеток млекопитающих, аксолотальные эпендимальные клетки остаются в виде нервных стволовых клеток (НСК) после эмбрионального развития. После травмы спинного мозга (например, от ампутации хвоста), эти NSCs размножаться, чтобы вырастить эпендимальной трубки и дифференцировать, чтобы заменить потерянные нейроны1,2,3. Раскрытие того, как аксолотл спинного мозга NSCs остаются плюрипотентными и активировать после травмы может предоставить ценную информацию о разработке новых терапевтических стратегий для пациентов.
В связи с достижениями в CRISPR-Cas9 ген нокаут техники, выполнение нокаутов, чтобы расшифровать функцию гена стало легче и было показано, что широкое применимость в различных видах, в том числе аксолотлы4,5, 6 , 7 (г. , 8. Недавний выпуск полного генома аксолоцла и транскриптома теперь позволяет любой геномный локус быть мишенью и для лучшей оценки вне целевых эффектов9,10,11,12 , 13 Год , 14. Разработаны оптимизированные протоколы для нокаута и стука в аксолотах с использованием системы CRISPR-Cas915. Доставка оборудования CRISPR-Cas9 в виде циноворенного рибонуклеопротеина CAS9 (РНП) оказалась более эффективной, чем использование плазмид Cas9 и gRNA-encoding4. Это, вероятно, из-за RNP быть меньше по размеру, чем плазмидные векторы, его способность создавать ДНК перерывы немедленно, и защита гРНК от деградации РНК. Кроме того, использование RNPs обходит транскрипцию и перевод; Таким образом, он избегает таких вопросов, как прочность промотора и оптимальное использование кодона, когда плазмидные элементы являются производными от различных видов.
Исследования потери функций являются одним из общих подходов к изучению потенциальных функций генов, представляющих интерес. Для того, чтобы изучить функцию генов во время регенерации, нокаут в идеале должны быть выполнены непосредственно перед травмой, чтобы избежать воздействия на развитие. Кроме того, выбивка должна быть ограничена как НСК, так и областью регенерации. Выбив из целевого гена во всех NSCs (в том числе в головном мозге, что имеет место в системах Cre-LoxP), может производить эффекты, не связанные с регенерацией, которые могут сбить с толку интерпретацию результатов. К счастью, структура аксолотового спинного мозга предоставляет уникальную возможность для времени и ограниченного пространства нокаутом в НСК. Большинство спинного мозга NSCs находятся в контакте с центральным каналом и составляют подавляющее большинство клеток в контакте с центральным каналом16,17. Таким образом, инъекция комплекса CAS9-gRNA в центральный канал, за которым следует электропорация, позволяет доставлять в спинной мозг НСК в нужном регионе в определенное время4,18,19. Этот протокол демонстрирует, как это выполняется, что приводит к весьма проникающим нокаутом в целевом спинном мозге NSCs. Последующий анализ затем проводится для изучения влияния на регенерацию и поведение НСК.
Protocol
Representative Results
Discussion
Описанный протокол позволяет времени и пространства ограниченного гена нокаут в NSCs в аксолотель спинного мозга. Текущий протокол позволяет конкретно таргетинга НСК в определенное время и место с высоким penetrance. Он позволяет избежать потенциальных нежелательных эффектов, происходящих…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим профессора Элли М. Танаку за ее постоянную и долгосрочную поддержку. Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (NSFC) Грант (317716), исследования Начиная гранты от южнокитайского университета нормальный (S82111 и 8S0109), и Китай постдокторской науки Фонд Грант (2018M633067).
Materials
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | |
| Benzocaine | Sigma-Aldrich | E1501-100G | |
| Benzocaine 0.03 % (wt/vol) | Mix 500 ml of 10× TBS, 500 ml of 400% (wt/vol) Holtfreter’s solution and 30 ml of 10% (wt/vol) benzocaine stock solution. Fill up the volume to 10 L with dH2O. The solution can be stored at room temperature for up to 6 months. | ||
| Benzocaine 10 % (wt/vol) | Mix 50 g of benzocaine in 500 ml of 100% (vol/vol) ethanol. The solution can be stored at room temperature for up to 12 months. | ||
| Borosilicate glass capillaries 1.2 mm O.D., 0.94 mm I.D. | Stutter Instrument | BF120-94-8 | |
| CaCl2·2H2O | Merck | 102382 | |
| CAS9 buffer, 10x | Mix 200 mM HEPES and 1.5 M KCl in RNase-free water. Adjust pH to 7.5. Filter sterilize, aliquot and store at −20 °C for up to 24 months | ||
| CAS9-NLS protein | PNA Bio | CP03 | |
| Cell culture dishes, 10cm | Falcon | 351029 | |
| Dumont #5 – Fine Forceps | Fine Scientific Instruments | 11254-20 | |
| Electroporator | Nepa Gene | NEPA21 | |
| BEX | Pulse Generator CUY21EDIT II | ||
| Fast Green FCF | Sigma-Aldrich | F7252-5G | |
| Fast Green FCF Solution, 5x | Dissolve 12.5 mg of Fast Green FCF powder in 10 mL of 1× PBS. | ||
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Stutter Instrument | P-97 | |
| Holtfreter’s solution 400% (wt/vol) | Dissolve 11.125 g of MgSO4·7H2O, 5.36 g of CaCl2·2H2O, 158.4 g of NaCl and 2.875 g of KCl in 10 L of dH2O. The solution can be stored at room temperature for up to 6 months. | ||
| KCl | Merck | 104936 | |
| MgSO4·7H2O | Merck | 105886 | |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 5242956003 | |
| Micromanipulator | Narishige | MN-153 | |
| NaCl | Merck | 106404 | |
| Pneumatic PicoPump | World Precision Instruments | SYS-PV830 | |
| Ring Forceps | Fine Scientific Instruments | 11103-09 | |
| Stereomicroscope | Olympus | SZX10 | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | T6066 | |
| Tris-buffered saline, 10x | Dissolve 24.2 g of Tris base and 90 g of NaCl in 990 ml of dH2O. Adjust pH to 8.0 by adding 10 ml of 37% (vol/vol) HCl. The solution can be stored at room temperature for up to 6 months. | ||
| Tweezers w/Variable Gap 2 Round Platinum Plate Electrode, 10mm diameter | Nepa Gene | CUY650P10 |
References
- O’Hara, C. M., Egar, M. W., Chernoff, E. A. G. Reorganization of the ependyma during axolotl spinal cord regeneration: Changes in intermediate filament and fibronectin expression. Developmental Dynamics. 193 (2), 103-115 (1992).
- Mchedlishvili, L., Mazurov, V., Tanaka, E. M. Reconstitution of the Central Nervous System During Salamander Tail Regeneration from the Implanted Neurospheres. Plant, Soil and Environment. 916 (8), 197-202 (2012).
- Nordlander, R. H., Singer, M. The role of ependyma in regeneration of the spinal cord in the urodele amphibian tail. Journal of Comparative Neurology. 180 (2), 349-373 (1978).
- Fei, J. F., et al. Tissue- and time-directed electroporation of CAS9 protein–gRNA complexes in vivo yields efficient multigene knock-out for studying gene function in regeneration. npj Regenerative Medicine. 1 (1), 16002 (2016).
- Fei, J. F., et al. CRISPR-mediated genomic deletion of Sox2 in the axolotl shows a requirement in spinal cord neural stem cell amplification during tail regeneration. Stem Cell Reports. 3 (3), 444-459 (2014).
- Flowers, G. P., Timberlake, A. T., McLean, K. C., Monaghan, J. R., Crews, C. M. Highly efficient targeted mutagenesis in axolotl using Cas9 RNA-guided nuclease. Development. 141 (10), 2165-2171 (2014).
- Flowers, G. P., Sanor, L. D., Crews, C. M. Lineage tracing of genome-edited alleles reveals high fidelity axolotl limb regeneration. eLife. 6, (2017).
- Fei, J. -. F., et al. Efficient gene knockin in axolotl and its use to test the role of satellite cells in limb regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences. 201706855. , (2017).
- Nowoshilow, S., et al. The axolotl genome and the evolution of key tissue formation regulators. Nature. 554 (7690), 50-55 (2018).
- Bryant, D. M., et al. A Tissue-Mapped Axolotl De Novo Transcriptome Enables Identification of Limb Regeneration Factors. Cell Reports. 18 (3), 762-776 (2017).
- Smith, J. J., et al. A chromosome-scale assembly of the axolotl genome. Genome Research. 373548, (2019).
- Smith, J. J., et al. Sal-Site: Integrating new and existing ambystomatid salamander research and informational resources. BMC Genomics. 6, 1-6 (2005).
- Campbell, L. J., et al. et al Gene expression profile of the regeneration epithelium during axolotl limb regeneration. Developmental Dynamics. 240 (7), 1826-1840 (2011).
- Stewart, R., et al. Comparative RNA-seq Analysis in the Unsequenced Axolotl: The Oncogene Burst Highlights Early Gene Expression in. the Blastema. PLoS Computational Biology. 9 (3), (2013).
- Fei, J. -. F., et al. Application and optimization of CRISPR–Cas9-mediated genome engineering in axolotl (Ambystoma mexicanum). Nature Protocols. 13 (12), 2908-2943 (2018).
- Holder, N., et al. Continuous growth of the motor system in the axolotl. Journal of Comparative Neurology. 303 (4), 534-550 (1991).
- Tazaki, A., Tanaka, E. M., Fei, J. F. Salamander spinal cord regeneration: The ultimate positive control in vertebrate spinal cord regeneration. Biologie du développement. 432 (1), 63-71 (2017).
- Albors, A. R., Tanaka, E. M. High-Efficiency Electroporation of the Spinal Cord in Larval Axolotl. Salamanders in Regeneration Research: Methods and Protocols. 1290, 115-125 (2015).
- Albors, A. R., et al. et al Planar cell polarity-mediated induction of neural stem cell expansion during axolotl spinal cord regeneration. eLife. 4, 1-29 (2015).
- Cong, L., et al. Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Doench, J. G., et al. Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9. Nature Biotechnology. 34 (2), 184-191 (2016).
- Graham, D. B., Root, D. E. Resources for the design of CRISPR gene editing experiments. Genome Biology. 16 (1), 260 (2015).
- Khattak, S., et al. Optimized axolotl (Ambystoma mexicanum) husbandry, breeding, metamorphosis, transgenesis and tamoxifen-mediated recombination. Nature Protocols. 9 (3), 529-540 (2014).
