실험 연구를 위한 해양 펠라기 투니케이트 돌리오레타 게겐바우리 재배 (울자닌 1884)
Summary
돌리올리다 게겐바우리종을 포함한 돌리올리드는 전 세계적으로 생산적인 아대륙 선반 시스템에서 발견되는 생태학적 중요성의 작은 젤라틴 해양 동물플랑크톤이다. 이 섬세한 유기체를 배양하는 어려움은 그들의 조사를 제한합니다. 본 연구에서는 돌리올리야게겐바우리(doliolid Dolioletta gegenbauri)를수집, 사육 및 유지하기 위한 재배 접근법을 설명합니다.
Abstract
젤라틴 동물원 플랑크는 해양 생태계에서 중요한 역할을합니다. 그러나, 그들의 생리학을 조사 하는 것이 일반적으로 어렵다, 성장, fecundity, 그리고 영양 상호 작용 주로 방법론 적 도전으로 인해, 그들을 배양 하는 능력을 포함 하 여. 이것은 돌리올리드, 돌리올레타 게겐바우리에 특히 사실이다. D. gegenbauri 일반적으로 생산적인 아열대 대륙 선반 시스템에서 발생, 종종 매일 기본 생산의 큰 부분을 소비 할 수있는 꽃 농도에서. 이 연구에서는 실험실 기반 연구를 수행하기 위한 목적으로 D. 게겐바우리(Gegenbauri)를 수집, 사육 및 유지 관리하는 재배 방법을 설명합니다. D. 게겐바우리 및 기타 돌리올리드 종은 표류하는 선박으로부터 202 μm 메쉬 플랑크톤 그물을 비스듬히 견인하여 살아서 포획할 수 있다. 배양은 수온이 21 °C 이하이고 미성숙한 여조, 숙성 포로주이드 및 대형 간호사로부터 시작될 때 가장 안정적으로 확립됩니다. 배양은 천천히 회전하는 플랑크톤 휠에 둥근 배양 용기에서 유지될 수 있으며 여러 세대에 걸쳐 천연 해수에서 배양된 조류의 식단을 유지할 수 있습니다. D. 게겐바우리(D. gegenbauri)의실험실 배양을 확립하는 능력 외에도, 우리는 자연적으로 조절된 바닷물에 대한 수집 상태, 조류 농도, 온도 및 노출이 모두 문화에 중요하다는 것을 입증합니다. D. 게겐바우리의 설립, 성장, 생존 및 번식.
Introduction
동물플랑크톤은 바다에서 가장 큰 동물 바이오매스를 차지하고 있으며, 해양 식품 거미줄의 핵심 구성요소이며 해양 생물지구화학 주기 1,2에서중요한 역할을 한다. 동물플랑크톤은 생물체의 거대한 다양성으로 구성되어 있지만, 두 가지 범주로 크게 구별 될 수있다 :몇 중간 택시 3,4와젤라틴과 비 젤라틴 . 젤라틴 동물플랑크톤이 아닌 동물성 동물플랑크톤에 비해, 젤라틴 동물플랑크톤은 복잡한 삶의역사5 때문에 공부하기가 특히 어렵고, 포획 및 취급 중에 섬세한 조직이 쉽게 손상됩니다. 젤라틴 동물플랑크톤 종은, 따라서, 실험실에서 배양하기가 어렵고 일반적으로 비젤라틴종6에 비해 덜 연구된다.
젤라틴 동물플랑크톤 그룹 중 에는 전 세계 바다에서 풍부하고 생태학적으로 중요한 것이 탈리아세안(Thaliaceans)입니다. 탈리아세산은 살피다, 피로소미다, 돌리오리다 7의 주문을 포함하는 원골 잡화의한 등급이다. 돌리올리다(Doliolida)는 아열대 바다의 생산적인 네릭 지역에서 높은 풍부에 도달할 수 있는 작은 배럴 모양의 자유 수영 펠라그 생물입니다. 돌리올리드는 모든 동물플랑크톤 그룹4,8중 가장 풍부하다. 서스펜션 피더로서, doliolids는 필터 전류를 생성하고 점액 그물9에캡처하여 물 기둥에서 음식 입자를 수집합니다. 분류학적으로, 돌리올리드는 phylum Urochordata10에서분류된다. 조상은 코르다테에 대한 조상이며, 해양 펠라그 시스템의 핵심 구성 요소로서의 생태학적 중요성외에도, 탈리아세산은 식민지 생명의 역사10,11 및 진화의 기원을 이해하는 데 중요합니다. 5,7,10,12,13,14.
doliolids의 생활 역사는 복잡 하 고 그들의 수명 주기를 통해 그들을 배양 하 고 유지에 어려움에 기여. 돌리오리드 수명 주기와 해부학에 대한 리뷰는 Godeaux 외15에서찾을 수 있습니다. 성및 무성생애주기간의 의무적인 교대를 수반하는 돌리올리드 수명주기는 그림1에 제시되어 있다. 계란과 정자는 생애 주기의 유일한 고독한 단계인 헤르마로디틱 고노주이드에 의해 생성됩니다. Gonozooids는 물 기둥에 정액을 풀어 놓이고 계란은 내부적으로 기름지게 하고 애벌레로 발전하기 위하여 풀어 놓입니다. 유충 해치와 1-2 mm에 도달 할 수있는 oozooids로 변신. 도움이 환경 조건과 영양을 가정, oozooids는 20 °C에서 1-2 일 이내에 초기 간호사가되고 수명 주기의 식민지 단계를 시작합니다. Oozooids 무성 그들의 복부 stolon에 싹을 생산. 이 싹은 stolon을 떠나 그들이 세 개의 쌍을 이루는 행에 줄 등도 카도포어로 마이그레이션합니다. 중앙 이중 행은 공포증이 되고 바깥쪽 두 개의 이중 행은 트로포주이드가 됩니다. 후자는 간호사와 포로주시드 모두에게 음식을 제공합니다16,17. 트로포주이드는 간호사에게 모든 내부 장기를 잃으면서 영양을 공급합니다. trophozooids의 풍부가 증가함에 따라, 간호사의 크기는 실험실에서 15mm에 도달 할 수 있습니다. 포로주이드가 자라면서, 그들은 점점 플랑크토닉 먹이를 섭취하고 개인17로출시되기 전에 ~ 1.5 mm 크기에 도달한다. 한 명의 간호사가 수명18동안 > 100 개의 포지주이드를 방출 할 수 있습니다. 공포증이 카도포어에서 풀어 놓인 후에, 그(것)들은 성장을 계속하고 생활 주기의 두 번째 식민지 단계입니다. 일단 그들이 ~ 5mm 크기에 도달하면, 각 포주이드는 복부 페던클에 고노 주이드의 클러스터를 개발합니다. 이 고지체는 길이가 ~1mm에 도달하면 입자를 섭취 할 수 있습니다. gonozooids가 크기에 ~ 2 ~ 3mm에 도달 한 후 그들은 광주체이드에서 방출되고 수명 주기의 유일한 독방 단계가됩니다. 일단 그들이 도달하면 ~ 6mm 크기로, 고노 주이드는 성적으로 성숙17이된다 . 고노주이드는 길이가 9mm 이상에 달할 수 있습니다. 고노주이드는 헤르마로디틱이며, 정자는 간헐적으로 방출되고, 난자의 수정은 내부적으로16,17에서발생한다. 가노주이드의 크기가 ≥ 6 mm일 때, 최대 6개의 수정란을 방출합니다. 성공적인 배양은 이러한 독특한 삶의 역사 단계각각의 특정 한 요구를 지원해야 합니다.
돌리올리드를 포함한 탈리아세산의 생태학적, 진화적 중요성으로 인해, 이 유기체의 독특한 생물학, 생리학, 생태학 및 진화역사의 이해를 증진시키기 위한 재배 방법론이 필요하다19 . Doliolids는 발달 생물학 및 기능성 유전체학에 있는 실험적인 모형 유기체로 상당한 약속이 있기 때문에 투명하고 가능성이 유전체20,21. 그러나 신뢰할 수있는 재배 방법의 부족은 실험실 모델로의 유용성을 방해합니다. 소수의 실험실이 배양 된 돌리오 리드를 기반으로 결과를 발표했지만, 우리의 지식 재배 접근 법 및 자세한 프로토콜은 이전에 출판되지 않았습니다. 다년간의 경험과 시행착오 배양 시도를 바탕으로, 이 연구의 목적은 경험을 검토하고 돌리올라이드, 특히 돌리오레타 게겐바우리종의 수집 및 재배를 위한 프로토콜을 공유하는 것이었다.
Protocol
Representative Results
Discussion
문화 doliolids 수용량은 지난 수십 년 동안 설립되었으며 여러 분야에서 연구를 지원하는 데 사용되었습니다. 우리의 실험실에서 실험 연구는 먹이 와 성장에 초점을 맞춘 적어도 15 과학 연구의 출판을 지원 했다18,26,재생18,28,다이어트6, 29,생리학30,</su…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
G.A를 포함하여 수년에 걸쳐 이 프로젝트에 축적된 지식을 기부해 주신 많은 분들에게 감사드립니다. 파펜회퍼와 D. 데이벨은 원래 이러한 프로토콜을 개발했다. M. Köster, 그리고 L. Lamboley는 또한 이 절차의 발달에 크게 기여했습니다. N.B. 로페즈-피게로아와 아에 로드리게스-산티아고는 표 1에 제공된 돌리올리드 풍부도의 추정치를 생성했다. 이 연구는 MEF에 OCE 082599, 1031263, 공동 프로젝트 OCE 1459293 및 OCE 14595010 MEF와 DMG에, 국립 해양 및 대기 관리 상 NA16SEC4810007에 의해 부분적으로 지원되었다. 우리는 R / V 사바나의 근면하고 전문적인 승무원에게 감사드립니다. 리 앤 델레오(Lee Ann DeLeo)가 피규어를 준비했고, 찰스 Y. 로버트슨이 원고를 교정했고, 제임스(지미) 윌리엄스가 플랑크톤 휠을 제작했습니다.
Materials
| Algal culture tubes (55 mL sterile disposable glass culture tubes) | Any | NA | For algal cultures |
| Autoclave | Any | NA | For sterilizing equipment and seawater for algal cultures |
| Beakers (2 L glass) | Any | NA | For sorting diluted plankton net tow contents |
| Buckets (5 gallon, ~20L) | Any | NA | For diluting contents of planton net tow – should be seawater conditioned before first use |
| Carboys (20 L) | Any | NA | For storing seawater |
| Doliolid glass culturing jar (1.9 L narrow mouth glass jar with cap) | Qorpak | GLC-01882 | Container for culture |
| Doliolid glass culturing jar (3.8 L narrow mouth glass jar with cap) | Qorpak | GLC-01858 | Container for culture |
| Environmental Chamber (Temperature controlled enviromental chamber) | Any | NA | To accommodate plankton wheel and culture maintenance |
| Filtration apparatus for 47 mm filters | Any | NA | For filtering seawater for cultures |
| Glass microfiber filters, 47 mm | Whatman | 1825-047 | For filtering seawater for cultures |
| Glass pipette (borosillicate glass pipette (glass tubing), OD 10mm, ID 8 mm, wall thickness 1mm) | Science Company | NC-10894 | Custom cut and edges polished |
| Hose clamps, stainless steel, #104 (178 mm) | Any | NA | For holding culturing jars to the plankton wheel |
| Isochrysis galbana strain CCMP1323 | National Center for Marine Algae and Microbiota (NCMA) | strain CCMP1323 | For feeding doliolid cultures |
| L1 Media Kit, 50 L | National Center for Marine Algae and Microbiota (NCMA) | MKL150L | For culturing algae |
| Lamp (Fluorescent table lamp with an adjustable arm) | Any | NA | For illuminating doliolids in the jars and beakers |
| Lighted temperature controlled incubator | Any | NA | For algal cultures |
| Micropipettes and sterile tips (0-20 µl, 20-200 µl, 200-1000 µl) | Any | NA | For algal cultures |
| Plankton Net (202 µm 0.5 m, 5:1 length) with cod end ring and 4 L aquarium cod-end | Sea-Gear Corporation | 90-50×5-200-4A/BB | For collecting living doliolids (see Figure 4) |
| Plankton Wheel | NA | NA | Custom built (see Figure 2) |
| Plastic wrap | Any | NA | To cover inside of lid of doliolid culture jars |
| Potassium Permanganate | Fisher Scientific | P279-500 | Reagent for cleaning jars and glassware |
| Rhodomonas sp. strain CCMP740 | National Center for Marine Algae and Microbiota (NCMA) | strain CCMP740 | For feeding doliolid cultures |
| Rubber Tubing | NA | NA | For holding culturing jars to the plankton wheel (can be made from tygon tubing) |
| Sodium Bisulfite | Fisher Scientific | S654-500 | Reagent for cleaning jars and glassware |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | BP359-212 | Reagent for cleaning jars and glassware |
| Sterile serological pipettes (1 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL) | Any | NA | For algal cultures |
| Thalassiosira weissflogii strain CCMP1051 | National Center for Marine Algae and Microbiota (NCMA) | strain CCMP1051 | For feeding doliolid cultures |
| Tissue culture flasks (250 mL) | Any | NA | For algal cultures |
References
- Banse, K. Zooplankton – Pivotal role in the control of ocean production. Ices Journal of Marine Science. 52 (3-4), 265-277 (1995).
- Wilson, S. E., Ruhl, H. A., Smith, K. L. Zooplankton fecal pellet flux in the abyssal northeast Pacific: A 15 year time-series study. Limnology and Oceanography. 58 (3), 881-892 (2013).
- Bode, A., Álvarez-Ossorio, M. T., Miranda, A., Ruiz-Villarreal, M. Shifts between gelatinous and crustacean plankton in a coastal upwelling region. Ices Journal of Marine Science. 70 (5), 934-942 (2013).
- Kiorboe, T. Zooplankton body composition. Limnology and Oceanography. 58 (5), 1843-1850 (2013).
- Holland, L. Z. Tunicates. Current Biology. 26 (4), R146-R152 (2016).
- Walters, T. L., et al. Diet and trophic interactions of a circumglobally significant gelatinous marine zooplankter, Dolioletta gegenbauri (Uljanin, 1884). Molecular Ecology. , (2018).
- Piette, J., Lemaire, P. Thaliaceans, the neglected pelagic relatives of ascidians: a developmental and evolutionay enigma. Quarterly Review of Biology. 90 (2), 117-145 (2015).
- Acuña, J. L. Pelagic tunicates: Why gelatinous?. American Naturalist. 158 (1), 100-107 (2001).
- Alldredge, A. L., Madin, L. P. Pelagic tunicates – unique herivores in the marine plankton. Bioscience. 32 (8), 655-663 (1982).
- Wada, H. Evolutionary history of free-swimming and sessile lifestyles in urochordates as deduced from 18S rDNA molecular phylogeny. Molecular Biology and Evolution. 15 (9), 1189-1194 (1998).
- Zeng, L. Y., Jacobs, M. W., Swalla, B. J. Coloniality has evolved once in stolidobranch ascidians. Integrative and Comparative Biology. 46 (3), 255-268 (2006).
- Delsuc, F., Brinkmann, H., Chourrout, D., Philippe, H. Tunicates and not cephalochordates are the closest living relatives of vertebrates. Nature. 439 (7079), 965-968 (2006).
- Garstang, W. The morphology of the Tunicata, and its bearing on the phylogeny of the chordata. Quarterly Journal of Microscopical Science. 72 (285), 51-187 (1929).
- Govindarajan, A. F., Bucklin, A., Madin, L. P. A molecular phylogeny of the Thaliacea. Journal of Plankton Research. 33 (6), 843-853 (2011).
- Godeaux, D., Bone, Q., Braconnot, J. C., Bone, Q. . The Biology of Pelagic Tunicates. , 1-24 (1998).
- Deibel, D., Lowen, B. A review of the life cycles and life-history adaptations of pelagic tunicates to environmental conditions). Ices Journal of Marine Science. 69 (3), 358369 (2012).
- Paffenhöfer, G., Köster, M. From one to many: on the life cycle of Dolioletta gegenbauri Uljanin (Tunicata, Thaliacea). Journal of Plankton Research. 33 (7), 1139-1145 (2011).
- Paffenhöfer, G. A., Gibson, D. M. Determination of generation time and asexual fecundity of doliolids (Tunicata, Thaliacea). Journal of Plankton Research. 21 (6), 1183-1189 (1999).
- Conley, K. R., Lombard, F., Sutherland, K. R. Mammoth grazers on the ocean’s minuteness: a review of selective feeding using mucous meshes. Proceedings of the Royal Society B-Biological Sciences. 285 (1878), (2018).
- Bouquet, J. M., et al. Culture optimization for the emergent zooplanktonic model organism Oikopleura dioica. Journal of Plankton Research. 31 (4), 359370 (2009).
- Denoeud, F., et al. Plasticity of Animal Genome Architecture Unmasked by Rapid Evolution of a Pelagic Tunicate. Science. 330 (6009), 1381-1385 (2010).
- Harrison, P. J., Waters, R. E., Taylor, F. J. R. A broad-spectrum artificial seawater medium for coastal and open ocean phytoplankton. Journal of Phycology. 16 (1), 2835 (1980).
- Ohman, M. D., et al. Zooglider: An autonomous vehicle for optical and acoustic sensing of zooplankton. Limnology and Oceanography-Methods. 17 (1), 69-86 (2019).
- Takahashi, K., et al. In situ observations of a doliolid bloom in a warm water filament using a video plankton recorder: Bloom development, fate, and effect on biogeochemical cycles and planktonic food webs. Limnology and Oceanography. 60 (5), 1763-1780 (2015).
- Deibel, D., Bone, Q. . The biology of pelagic tunicates. , 171-186 (1998).
- Gibson, D. M., Paffenhöfer, G. A. Feeding and growth rates of the doliolid, Dolioletta gegenbauri Uljanin (Tunicata, Thaliacea). Journal of Plankton Research. 22 (8), 1485-1500 (2000).
- Haskell, A., Hofmann, E., Paffenhöfer, G., Verity, P. Modeling the effects of doliolids on the plankton community structure of the southeastern US continental shelf. Journal of Plankton Research. 21 (9), 1725-1752 (1999).
- Gibson, D. M., Paffenhöffer, G. A. Asexual reproduction of the doliolid, Dolioletta gegenbauri Uljanin (Tunicata, Thaliacea). Journal of Plankton Research. 24 (7), 703-712 (2002).
- Frischer, M. E., et al. Reliability of qPCR for quantitative gut content estimation in the circumglobally abundant pelagic tunicate Dolioletta gegenbauri (Tunicata, Thaliacea). Food Webs. 1, 7 (2014).
- Köster, M., Paffenhöfer, G., Baker, C., Williams, J. Oxygen consumption of doliolids (Tunicata, Thaliacea). Journal of Plankton Research. 32 (2), 171-180 (2010).
- Paffenhöfer, G. A hypothesis on the fate of blooms of doliolids (Tunicata, Thaliacea). Journal of Plankton Research. 35 (4), 919-924 (2013).
- Takahashi, K., et al. Sapphirinid copepods as predators of doliolids: Their role in doliolid mortality and sinking flux. Limnology and Oceanography. 58 (6), 1972-1984 (2013).
- Martí-Solans, J., et al. Oikopleura dioica Culturing Made Easy: A Low-Cost Facility for an Emerging Animal Model in EvoDevo. Genesis. 53 (1), 183-193 (2015).
- Nishida, H. Development of the appendicularian Oikopleura dioica: Culture, genome, and cell lineages. Development Growth & Differentiation. 50, S239-S256 (2008).
