Isolamento de células mononucleares de lamina propria de cólon murino usando Collagenase E

Embora o trato gastrointestinal (GI) é principalmente dedicado ao processamento e reabsorção de nutrientes de alimentos, o trato gastrointestinal também mantém papéis centrais na integridade dos sistemas vasculares, linfáticos e nervosos e de numerosos outros órgãos através seu sistema imunológico mucoso e submucoso¹. O sistema imunológico Gi tem um papel influente na saúde gastrointestinal e sistêmica, devido à sua exposição constante a antígenos estrangeiros de alimentos, bactérias comensais ou agentes invasores^1,2. Assim, o sistema imunológico gastrointestinal deve manter um equilíbrio delicado no qual tolera antígenos não patogênicos enquanto respondesse apropriadamente aos antígenos patogênicos^1,2. Quando o equilíbrio de tolerância e defesa é interrompido, a desregulação imune localizada ou sistêmica e a inflamação podem ocorrer resultando em uma infinidade de doenças^1,2,3.

O intestino abriga pelo menos 70% de todas as células linfóides no corpo⁴. A maioria de interações imunológicas preliminares envolvem pelo menos uma de três estações imunes no intestino: 1) Peyer ‘ remendos de s, 2) linfócitos intraepithelial (IEL) e 3) linfócitos do própria do lamina (LPL). Cada uma delas é composta por uma complexa rede interconectada de células imunes que respondem rapidamente aos desafios imunes normais no intestino⁵. Restrita ao estroma acima da musculatura Mucosae, a lâmina própria vagamente estruturada é o tecido conjuntivo da mucosa intestinal e inclui andaimes para o villus, a vasculatura, drenagem linfática e sistema nervoso mucoso, bem como muitos inatos e subconjuntos imunes adaptativos^6,7,8,9. As LPL são compostas por células T CD4⁺ e CD8⁺ em uma proporção aproximada de 2:1, células plasmáticas e células de linhagem mielóide, incluindo células dendríticas, mastócitos, eosinófilos e macrófagos⁶.

Há um interesse crescente em compreender o desregulação imune e a inflamação do intestino como pertence aos vários Estados da doença. Tais condições como a doença de Crohn e colite ulcerosa todos manifestam diferentes níveis de inflamação do cólon^10,11,12. Adicionalmente, os pacientes com desordens malignos ou não-malignos da medula ou do sistema imune que se submetem a uma transplantação allogeneic da medula (Allo-BMT) podem desenvolver várias formas da colite que incluem 1) toxicidade direta dos regimes condicionantes antes de BMT,2) infecções causadas por imunossupressão após BMT e 3) doença do enxerto versus hospedeiro (DECH) impulsionada por células T do tipo doador reagindo a antígenos de Allo nos tecidos após o BMT^13,14,15. Todas essas complicações pós-BMT resultam em alterações significativas no ambiente imunológico dos intestinos^16,17,18. O método proposto permite uma avaliação confiável do acúmulo de células imunes no cólon do camundongo e, quando aplicado aos receptores murinos após a TMO, facilita um ensaio eficiente de células imunes de doadores e receptores envolvidas na tolerância ao transplante^{19 ,20}. Causas adicionais de inflamação intestinal incluem malignidades, alergias alimentares, ou perturbação do microbioma intestinal. Este protocolo permite o acesso de pilhas mononucleares do intestino do cólon e, com modificações, aos leucócito do intestino pequeno em alguns destes modelos murino pré-clínicos.

Uma pesquisa PubMed usando os termos de pesquisa “intestino e célula imune e isolamento” revela mais de 200 publicações descrevendo métodos para a digestão do intestino delgado para extrair células imunes. Entretanto, uma busca similar da literatura para dois pontos não rende nenhuns protocolos bem delineados que especificam a isolação de pilhas imunes dos dois pontos. Isto pode ser porque o cólon tem mais camadas musculares e intersticiais, tornando-o mais difícil de digerir completamente do que o intestino delgado. Diferentemente dos protocolos existentes, este protocolo utiliza especificamente a Collagenase E de Clostridium histolyticum sem outras colagenases bacterianas (Collagenase D/Collagenase I). Nós demonstramos que, usando este protocolo, a digestão do tecido relativo ao cólon pode ser conseguida ao preservar a qualidade de pilhas imunes mononucleares isoladas do intestino (MNC) sem a adição de reagentes antiaglutonantes tais como o versenate do sódio (EDTA), Dispase II, e desoxirribonuclease i (DNase i)^21,22,23. Este protocolo é aperfeiçoado para permitir a extração robusta reprodutível de MNC viável do cólon murino para uns estudos dirigidos mais adicionais e deve emprestar-se ao estudo da imunologia do cólon ou (com modificações) o intestine pequeno^24, a ²⁵.