リステリア単球遺伝子感染症後のマウス脾臓におけるインシチュインターフェロンガンマ産生のイメージング
Summary
ここでは、マウス二次リンパ球器官におけるサイトカインインターフェロンガンマを分泌する細胞の局在化を可視化する簡単な共焦点イメージング法について述べた。このプロトコルは、多様な組織における他のサイトカインの可視化のために拡張することができる。
Abstract
サイトカインは細胞から分泌される小さなタンパク質であり、効果的な免疫応答に不可欠な細胞間通信を媒次化します。サイトカインの特徴の1つは、多くの細胞型によって産生され、多くの細胞型に影響を与えることができるので、その胸膜症である。そのため、より特異的な治療法を定義するためには、どの細胞がサイトカインを産生しているのかを理解するだけでなく、どの環境で細胞が生産するかを理解することが重要です。ここでは、細菌感染後のその場でサイトカイン産生を可視化する方法について説明する。この技術は、共焦点顕微鏡による天然環境におけるサイトカイン産生細胞のイメージングに依存する。これを行うには、組織切片は、サイトカイン染色と共に複数の細胞タイプのマーカーに対して染色される。この方法の鍵は、サイトカイン分泌が目的の組織を収穫する前に生体内で直接ブロックされ、産生細胞内に蓄積されたサイトカインの検出を可能にする。この方法の利点は複数です。第一に、サイトカインが産生される微小環境が保存され、最終的にはサイトカイン産生に必要なシグナルや、それらのサイトカインの影響を受ける細胞を知らせることができる。さらに、この方法は、産生細胞の人工インビトロ再刺激に依存しないため、生体内でのサイトカイン産生の位置を示す。しかし、サイトカインを受け取る細胞におけるサイトカイン下流シグナル伝達を同時に分析することはできない。同様に、観察されたサイトカイン信号は、サイトカイン分泌がブロックされた時間ウィンドウにのみ対応する。細胞内細菌リステリア単球遺伝子によるマウス感染後の脾臓におけるサイトカインインターフェロン(IFN)ガンマの可視化について説明するが、この方法は、任意のサイトカインの可視化に適応する可能性がある。ほとんどの臓器。
Introduction
病原体に対する効率的な免疫応答を調整するには、生物間に分散することが多い様々な免疫細胞によって表示されるシグナルの複雑な統合が必要です。通信するために、これらの細胞は、サイトカインという名前の免疫調節剤として機能する複数の生物学的機能を有する小さな可溶性タンパク質を産生する。サイトカインは細胞の募集、活性化および増殖を制御し、したがって免疫応答1の促進において重要なプレーヤーであることが知られている。効果的な免疫応答は、特定のシグナルを誘導するために特定の細胞を接続する非常に組織化された時空間パターンでサイトカインを放出する必要があります。したがって、サイトカインが産生される微小環境を考慮して、サイトカインの生産とそのシグナリングをその場で研究することが重要です。
リステリア単球遺伝子(L.単球遺伝子)は、マウスの細胞内病原体に対する免疫応答を研究するための主要モデルとして用いられるグラム陽性細胞内細菌である。1つのサイトカイン、IFNガンマ(IFNγ)は、L.単球遺伝子感染後24時間以内に急速に産生される。IFNγのためにノックアウトされたマウスはL.単球遺伝子感染2に対して非常に感受性が高いため、病原体クリアランスが必要である。IFNγは、多色性であり、感染3に続く複数の細胞によって産生される。ナチュラルキラー(NK)細胞によって産生されるIFNγは直接抗菌活性4に必要であるが、他の供給源からのIFNγは他の機能を有することが示されている。実際、我々および他の人々は最近、CD8+T細胞によって産生されるIFNγがT細胞分化5、6、7を直接調節する上で特定の機能を有することを見出した。そのため、どの細胞がIFNγを産生する(そしてどの微小環境で)その機能を解剖することが重要であるかを理解することが重要です。
サイトカイン産生を研究する最も一般的な技術は、フローサイトメトリーによって分析された細胞内サイトカイン染色に依存しています。この方法は、単一のサンプル内の細胞表面マーカーと組み合わせた複数のサイトカインの同時検出を可能にし、サイトカイン産生を研究するための非常に有用なツールを提供する。しかし、前述の手法を使用すると、空間情報が失わなされます。さらに、サイトカイン検出は、多くの場合、サイトカイン検出を可能にするためにインビトロ再刺激に依存しています。したがって、サイトカインを産生する所定の細胞の容量が分析され、必ずしもその場での実際のサイトカイン分泌と相関するわけではない。他の方法は、蛍光タンパク質発現がサイトカイン転写と相関し、単細胞レベル8での視覚化を可能にするレポーターマウスを使用する。この方法は、サイトカイン転写をその場で追跡することができますが、利用可能なサイトカインレポーターマウスの数は限られています。さらに、転写、翻訳、分泌はリンク解除されることがあり、蛍光タンパク質は報告するサイトカインとは異なる半減期を有し、この方法はサイトカインの可視化に適さない場合があります。
ここでは、単一細胞分解能で共焦点顕微鏡によるサイトカイン産生を可視化する方法について述べた。この技術は、組織内の細胞源および周囲のニッチの可視化を可能にする。このプロトコルは、特にL.単球遺伝子感染マウスの脾臓におけるIFNγ産生の可視化を説明し、NK細胞および抗原特異的CD8+T細胞によるIFNγ産生に焦点を当てる。しかし、標的サイトカインを細胞内に保持できる限り、感染症、炎症、自己免疫疾患などのサイトカインが産生される他の状況の文脈において、サイトカイン産生の特性を拡張し、適応させることができる。細胞内タンパク質輸送阻害剤によって。
Protocol
Representative Results
Discussion
本原稿では,マウスにおけるL.単球遺伝子感染後の脾臓におけるIFNγ産生を可視化する方法を提示する.このプロトコルは単純であり、他の組織およびサイトカイントリガに適応することができるが、以下の側面を考慮する必要がある。細胞はしばしば、彼らが産生するサイトカインを急速に分泌し、サイトカインは隣接する細胞によって急速に拾われる。サイトカインをその中で検出することは非常に困難です。サイトカイン産生を迅速に再開する一般的な方法は、酵素結合免疫吸着アッセイによって培地中のサイトカイン検出に続いて細胞を再刺激する。この文脈では、サイトカイン産生細胞の空間的局在化に関する情報は失われる。さらに、再刺激後のサイトカイン産生は、必ずしもサイトカインが実際に生体内で産生され分泌されるかどうかを反映するものではなく、むしろサイトカインを産生する所定の細胞集団の能力を示す。したがって、どちらの方法も異なる情報を提供し、どの情報が実験に最も価値があるかを考慮する必要があります。
細胞内サイトカインを検出するために、我々の方法は細胞内タンパク質輸送阻害剤を使用して細胞内のサイトカインをトラップし、シグナル検出を増加させる。しかし、これらの阻害剤は、内皮網膜(RE)からゴルジ装置へのタンパク質の正常な輸送に影響を及ぼし、その放出を損なう分泌性小胞に影響を与え、毒性を引き起こす可能性があることに注意することが重要である。その結果、BFA、または他の阻害剤は、短期間、通常は数時間以下で使用されるべきである。したがって、重篤な細胞毒性作用を引き起こすことなく細胞内に閉じ込められたサイトカインのレベルを最適化するためには、阻害剤の投与量と治療時間の間の適切なバランスを見つけることが重要です。これらの変数は、サイトカインとBFAの投与経路によって異なる場合があります。我々の感染モデルでは、BFAは迅速な全身分散を提供するために経後経口投与されたが、静脈内に送達することもできる。
最も一般的に使用される細胞内タンパク質輸送阻害剤は、BFA、ここで使用される、およびモネンシン(MN)である。これらの阻害剤は、多くの場合、サイトカインの生産を蓄積し、研究するために不明瞭に使用されますが、彼らは作用のメカニズムにわずかな違いを持っています.MNはゴルジ装置内のタンパク質の輸送を阻害するため、ゴルジ17にタンパク質を蓄積し、BFAは凝集体タンパク質複合体-Iの募集を防止し、小平血小乳網膜(ER)へのタンパク質の逆行運動を阻害する。そしてそれによってER18におけるサイトカインの蓄積を促進する。したがって、最良の細胞内タンパク質輸送阻害剤を選択することは、検出されるサイトカインなどの異なる要因に依存する。例えば、BFAがMN19よりもサイトカインIL-1β、IL-6およびTNFを測定する方が効率的である単球のリポ多糖誘発細胞内染色において示されている。
このプロトコルは、共焦点顕微鏡によるサイトカインの可視化を伴うため、サイトカイン産生細胞とその微小環境の研究に使用できるマーカーの数は限られています。また、BFAやMNなどのタンパク質輸送阻害剤が複数のタンパク質の正常な発現を妨げるため、特定の活性化細胞表面マーカーの同時発現を研究する際の使用が近づく必要があることも考慮する必要がある。慎重に。例えば、BfAではなくMNは、マウスリンパ球20におけるCD69の発現を遮断する。この制限にもかかわらず、共焦点イメージングは、細胞内のサイトカイン分泌の方向と同様に、サイトカインの細胞内局在化のサブ細胞的局在化を可能にする。このプロトコルを用いて生成されたデータは、NK細胞が拡散パターンでIFN-yを分泌する傾向があることを示唆し、CD8+T細胞はそれらと直接相互作用している他のCD8+T細胞に向かってIFNγ分泌を指示するように見える5。
結論として、このプロトコルは、その場で様々なサイトカインを可視化し、感染や自己免疫などの多くのトリガに続いて産生細胞とその微小環境を同定するのに適しています。得られた情報は、効率的な免疫応答に必要な、異なる細胞型およびそれらが生成するサイトカインの生体内空間オーケストレーションの重要性を理解するのに役立つ。
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ケネディ研究所イメージングファシリティのスタッフに、イメージングに関する技術支援を行っていただければと思います。この研究は、ケネディ・トラスト(A.G.)とバイオテクノロジー・生物科学研究評議会(BB/R015651/1からA.G.)の助成金によって支えられた。
Materials
| Brefeldin A | Cambridge bioscience | CAY11861 | |||
| Paraformaldehyde | Agar scientific | R1018 | |||
| L-Lysin dihydrochloride | Sigma lifescience | L5751 | |||
| Sodium meta-periodate | Thermo Scientific | 20504 | |||
| D(+)-saccharose | VWR Chemicals | 27480.294 | |||
| Precision wipes paper Kimtech science | Kimberly-Clark Professional | 75512 | |||
| O.C.T. compound, mounting medium for cryotomy | VWR Chemicals | 361603E | |||
| Fc block, purified anti-mouse CD16/32, clone 93 | Biolegend | 101302 | Antibody clone and Concentration used: 2.5 mg/ml | ||
| Microscope slides – Superfrost Plus | VWR Chemicals | 631-0108 | |||
| anti-CD169 – AF647 | Biolegend | 142407 | Antibody clone and Concentration used: clone 3D6.112 1.6 mg/ml Excitation wavelength: 650 Emission wavelength: 65 |
||
| anti-F4/80 – APC | Biolegend | 123115 | Antibody clone and Concentration used: clone BM8 2.5 mg/ml Excitation wavelength: 650 Emission wavelength: 660 |
||
| anti-B220 – PB | Biolegend | 103230 | Antibody clone and Concentration used: clone RA3-6B2 1.6 mg/ml Excitation wavelength: 410 Emission wavelength: 455 |
||
| anti-IFNg – biotin | Biolegend | 505804 | Antibody clone and Concentration used: clone XMG1.2 5 mg/ml | ||
| anti-IFNg – BV421 | Biolegend | 505829 | Antibody clone and Concentration used: clone XMG1.2 5 mg/ml Excitation wavelength: 405 Emission wavelength: 436 |
||
| anti-Nkp46/NCRI | R&D Systems | AF2225 | Antibody clone and Concentration used: goat 2.5 mg/ml | ||
| anti-goat IgG-FITC | Novusbio | NPp 1-74814 | Antibody clone and Concentration used: 1 mg/ml Excitation wavelength: 490 Emission wavelength: 525 |
||
| Streptavidin – PE | Biolegend | 405203 | Antibody clone and Concentration used: 2.5 mg/ml Excitation wavelength: 565 Emission wavelength: 578 |
||
| streptavidin – FITC | Biolegend | 405201 | Antibody clone and Concentration used: 2.5 mg/ml Excitation wavelength: 490 Emission wavelength: 525 |
||
| Fluoromount G | SouthernBiotech | 0100-01 | |||
| Cover glasses 22x40mm | Menzel-Glazer | 12352128 | |||
| Liquid blocker super PAP PEN mini | Axxora | CAC-DAI-PAP-S-M | |||
| Imaris – Microscopy Image Analysis Software | Bitplane | ||||
| Confocal microscope – Olympus FV1200 Laser scanning microscope | Olympus | ||||
| Cryostat – CM 1900 UV | Leica | ||||
| Base mould disposable | Fisher Scientific UK Ltd | 11670990 | |||
| PBS 1X | Life Technologies Ltd | 20012068 | |||
| BHI Broth | VWR Brand | 303415ZA | |||
| GFP | Excitation wavelength: 484 Emission wavelength: 507 |
||||
| RFP | Excitation wavelength: 558 Emission wavelength: 583 |
||||
| Insulin syringe, with needle, 29G | VWR International | BDAM324824 | |||
| C57BL/6 wild type mice | Charles River |
References
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