הדמיה של אינטרפרון באתרו הפקת גמא בטחול העכבר בעקבות זיהום יסטריה חיידקי
Summary
כאן, אנו מתארים מיקוד פשוט שיטה הדמיה כדי להמחיש את הלוקליזציה באתרו של תאים הפרשה את ציטוקינים אינטרפרון גמא באיברי הלימפה משני מוראין. פרוטוקול זה ניתן להארכה עבור ויזואליזציה של ציטוקינים אחרים ברקמות שונות.
Abstract
ציטוקינים הם חלבונים קטנים המופרשים על-ידי תאים, תקשורת תא תא מדיה חיוניים עבור תגובות החיסונית יעיל. מאפיין אחד של ציטוקינים הוא pleiotropism שלהם, כפי שהם מיוצרים על ידי והוא יכול להשפיע על המון סוגי תאים. ככזה, חשוב להבין לא רק אילו תאים מייצרים ציטוקינים, אלא גם באיזו סביבה הם עושים זאת, כדי להגדיר therapeutics ספציפי יותר. כאן, אנו מתארים שיטה להמחיש את הייצור cy, באתרו לאחר זיהום חיידקי. טכניקה זו מסתמכת על cytokine הדמיה-הפקת תאים בסביבה הטבעית שלהם על ידי מיקרוסקופ קונפוקלית וקד. לשם כך, מקטעי רקמות מוכתם סמנים של סוגי תאים מרובים יחד עם כתם ציטוקין. מפתח לשיטה זו, הפרשת ציטוקין חסומה ישירות בvivo לפני קצירת רקמת העניין, ומאפשר זיהוי של cy, שהצטברו בתוך התאים המייצרים. היתרונות של שיטה זו הם מרובים. ראשית, מיקרוסביבה שבה ציטוקינים מיוצרים נשמר, אשר יכול בסופו של דבר להודיע על האותות הדרושים לייצור cy, ואת התאים המושפעים על ידי ציטוקינים אלה. בנוסף, שיטה זו מציינת את המיקום של הפקת הציטוקין ב vivo, משום שהיא אינה נשענת על מלאכותית בגירוי מחדש של התאים המייצרים. עם זאת, לא ניתן לנתח בו cy, במורד הזרם איתות בתאים המקבלים את ציטוקינים. בדומה לכך, אותות הציטוקין שנצפו מתאימים רק לחלון הזמן שבמהלכו נחסם הפרשת ציטוקין. בעוד אנו מתארים את ההדמיה של ציטוקינים אינטרפרון (ifn) גמא בטחול לאחר זיהום העכבר על ידי חיידקים תאיים יסטריה monocytogenes, שיטה זו עשויה להיות מותאמת הדמיה של כל ציטוקין ב רוב האיברים.
Introduction
מארגן תגובה חיסונית יעילה נגד הפתוגן דורש אינטגרציה מורכבת של אותות המוצגים על ידי מגוון של תאים חיסוניים, כי הם התפזרו לעתים קרובות בין האורגניזם. על מנת לתקשר, תאים אלה לייצר חלבונים מסיסים קטנים עם פונקציות ביולוגיות מרובות הפועלות כמו אימונומודולטורים בשם ציטוקינים. בקרת ציטוקינים לגיוס תאים, הפעלה והפצה ולכן ידועים כנגני מפתח בקידום תגובות החיסון1. תגובות החיסון יעיל דורשים ציטוקינים להשתחרר בתבנית זמן מאורגנת מאוד חיבור תאים ספציפיים כדי לגרום לאותות ספציפיים. לכן, זה חיוני כדי ללמוד את הייצור cy, ואת האיתות שלה באתרו, לוקח בחשבון את מיקרוסביבה שבה ציטוקינים מיוצרים.
יסטריה מונוציטוטוגנס (L. חיידקי) הוא חיידק התאיים גרם-חיוביים המשמש כמודל הממשלה לחקור את התגובות החיסונית פתוגנים תאיים בעכברים. ציטוקין אחד, ifn גמא (IFNγ) מופק במהירות, בתוך 24 h לאחר זיהום L. חיידקי . יש צורך בסיווג הפתוגן, כמו עכברים שיצאו עבור IFNγ הם רגישים מאוד ל -L. מונציטוטוגנים זיהום2. IFNγ הוא pleiotropic והופק על ידי תאים מרובים בעקבות זיהום3. בעוד IFNγ המיוצר על ידי הרוצח הטבעי (NK) תאים נדרש עבור פעילות אנטי בקטריאלי ישירה4, IFNγ ממקורות אחרים הוכחו יש פונקציות אחרות. אכן, אנו ואחרים מצאו לאחרונה כי IFNγ המיוצר על ידי CD8 + T תאים יש פונקציה מסוימת באופן ישיר ויסות תא T בידול5,6,7. ככזה, הבנת אילו תאים מייצרים IFNγ (ובאיזו מיקרואקולוגיה) יש הכרחי לנתח את תפקודו.
הטכניקה הנפוצה ביותר כדי ללמוד הייצור cy, מסתמך על הצביעת ציטוקינים תאיים שנותחו על ידי הזרמת cy, לנסות. שיטה זו מאפשרת זיהוי סימולטני של ציטוקינים מרובים בשילוב עם סמנים פני השטח בתוך מדגם אחד, מתן כלי שימושי ביותר כדי ללמוד את הייצור ציטוקינים. עם זאת, שימוש בטכניקה הנ ל מרמז על אובדן כל מידע מרחבי. בנוסף, זיהוי cy, מסתמך בדרך כלל על גירוי מחדש של מבחנה כדי לאפשר זיהוי ציטוקין. ככזה, היכולת של תא מסוים לייצר ציטוקין מנותח, והיא אינה בהכרח מתאם עם הפרשת ציטוקין בפועל באתרו. שיטות אחרות משתמשות בעכברי כתבת שבהם ביטוי חלבון פלורסנט תואם לתמלול ומאפשר הדמיה ברמה של תא בודד8. למרות שיטה זו יכולה לעקוב אחר שעתוק ציטוקין באתרו, יש מספר מצומצם של עכברים כתבת הציטוקין זמין. בנוסף, שעתוק, תרגום הפרשה יכול לפעמים להיות מקושרים, וחלבונים פלורסנט יש מחצית חיים שונה מאשר cy, הם דיווחו, ביצוע שיטה זו לפעמים לא מספיק עבור הדמיית באתרו.
כאן, אנו מתארים שיטה להמחיש הפקה של ציטוקין באתרו על ידי מיקרוסקופ קונפוקלית וקד ברזולוציה תא יחיד. טכניקה זו מאפשרת הדמיה של המקור הסלולרי והנישה הסובבת בתוך הרקמה. פרוטוקול זה מתאר במפורש את ההדמיה של ייצור IFNγ בטחול של L. חיידקי נגועים, התמקדות כאן על הפקה IFNγ על ידי תאים NK ו אנטיגן מסוימים CD8+ T תאים. עם זאת, זה יכול להיות מורחב ומותאם לאפיון של כל ייצור cy, בהקשר של מצבים אחרים שבהם ציטוקינים מיוצרים כגון זיהום, דלקת או מחלות אוטואימוניות, כל עוד cy, ממוקד יכול להישמר בתאים על ידי מעכב הובלה בחלבון תאיים.
Protocol
Representative Results
Discussion
בכתב יד זה, אנו מציגים שיטה להמחיש IFNγ ייצור בטחול בעקבות זיהום L. חיידקי בעכברים. פרוטוקול זה הוא פשוט יכול להיות מותאם לרקמות אחרות מפעילים cy, אבל ההיבטים הבאים צריכים להיחשב. תאים לעתים קרובות מפרישות במהירות את ציטוקינים שהם מייצרים, ו ציטוקינים הם הרים במהירות על ידי תאים שכנים. זה כל כך קשה לזהות ציטוקינים באתרו. שיטה נפוצה ליזום מחדש במהירות הייצור cy, היא לגרות מחדש את התאים לשעבר vivo ואחריו הזיהוי ציטוקינים במדיה על ידי האנזים מקושר אנזימים המוכפופות. בהקשר זה, כל מידע על הלוקליזציה המרחבית של התאים המייצרים cytokine הוא איבד. בנוסף, ייצור cy, בעקבות גירוי מחדש לא בהכרח משקף אם ציטוקינים מיוצרים למעשה מופרש ב vivo, אלא מציין את הקיבולת של אוכלוסיית התאים נתון לייצר ציטוקינים. לכן, שתי השיטות יספקו מידע שונה והאדם צריך לשקול איזה מידע הוא בעל ערך רב לניסוי שלהם.
על מנת לזהות ציטוקינים תאיים, השיטה שלנו משתמשת הובלה חלבון תאיים מעכב למלכודות ציטוקינים בתוך התאים ולהגדיל את זיהוי האותות. עם זאת, חשוב לציין כי מעכבי אלה משפיעים על התעבורה הרגילה של חלבונים מרשת האנדותל (RE) למנגנון Golgi ולתוך שלפוחית הסוד הפוגעת בשחרורם, דבר שעלול לגרום לרעילות. כתוצאה מכך, BFA, או מעכב אחר, יש להשתמש לפרק זמן קצר, בדרך כלל לא יותר מכמה שעות. מכאן, חשוב למצוא את האיזון הנכון בין המינון המדכא ואת זמן הטיפול כדי לייעל את רמת ציטוקינים לכודים בתוך התא מבלי לגרום להשפעות חמורות ציטוטוקסינים. משתנים אלה יכולים להיות שונים בין ציטוקינים לבין תוואי המינהל של BFA. במודל הזיהום שלנו, BFA היה בניהול intraperitoneally על מנת לספק פיזור מערכתי מהיר, אבל זה יכול להיות גם מועברת באופן פנימי.
מעכבי התחבורה הנפוצים ביותר בשימוש בחלבון תאיים הם BFA, המשמשים כאן, ו-monensin (MN). מעכבי אלה משמשים לעתים קרובות לצבור וללמוד הייצור cy, אבל יש להם הבדלים קלים במנגנון הפעולה שלהם. MN מעכב הובלה של חלבונים בתוך מנגנון Golgi ולכן צבירת חלבונים ב-Golgi17 בעוד bfa מונע מורכבות חלבון coatomer-I גיוס, מעכב את התנועה נסיגה של חלבונים כדי הרשתית העין (ER) ובכך לקדם הצטברות של ציטוקינים במיון18. ככזה, בחירת מעכב התחבורה הטובה ביותר של חלבון תאיים יהיה תלוי בגורמים שונים, כגון cy, כדי להתגלות. למשל, זה הוצג ליפופוליסכד המושרה מכתים תאיים של מונוציטים כי BFA יעיל יותר למדוד את ציטוקינים IL-1β, IL-6 ו-TNF מאשר MN19.
פרוטוקול זה כרוך ויזואליזציה של cy, באתרו על ידי מיקרוסקופ קונפוקלית וקד, ולכן יש רק מספר מוגבל של סמנים מאשר ניתן להשתמש כדי ללמוד את cy, הפקת תאים ומיקרו הסביבה שלהם. יש צורך גם לשקול כי מעכבי הובלה חלבונים כגון BFA או MN להפריע הביטוי הרגיל של חלבונים מספר ומכאן השימוש שלהם כאשר לימוד ביטוי סימולטני של סמנים מסוימים משטח ההפעלה תא יש להתקרב בזהירות. לדוגמה, BFA אך לא MN חוסם את הביטוי של CD69 בלימפוציטים מורטין20. למרות מגבלה זו, הדמיה מוקד מאפשר לוקליזציה תת-תאית של ציטוקינים, כמו גם את הכיוון של הפרשת ציטוקין בתוך התא. הנתונים שנוצרו באמצעות פרוטוקול זה מראים כי תאי NK נוטים להפריש IFN-y בתבנית מפוזר בעוד CD8+ t תאים נראה להפנות את הפרשת IFNγ לעבר CD8 ותאי t אחרים הנמצאים באינטראקציה ישירה עם אותם5.
כדי להסיק, פרוטוקול זה מתאים להמחיש מגוון של ציטוקינים באתרו ולזהות הפקת תאים שלהם מיקרוסביבה בעקבות גורמים רבים כגון זיהום או חסינות עצמית. המידע המתקבל הוא אינסטרומנטלי כדי להבין את החשיבות של vivo מרחבית תזמור של סוגי תאים שונים הציטוקין שהם מייצרים, הכרחי לתגובה חיסונית יעילה.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לאנשי המרכז לדימות ממכון קנדי לקבלת סיוע טכני בהדמיה. עבודה זו תמכה במענקים מקרן קנדי (לתובע הכללי), ובמועצה למחקר ביוטכנולוגיה ומדעי הביולוגיה (BB/R015651/1 לתובע הכללי).
Materials
| Brefeldin A | Cambridge bioscience | CAY11861 | |||
| Paraformaldehyde | Agar scientific | R1018 | |||
| L-Lysin dihydrochloride | Sigma lifescience | L5751 | |||
| Sodium meta-periodate | Thermo Scientific | 20504 | |||
| D(+)-saccharose | VWR Chemicals | 27480.294 | |||
| Precision wipes paper Kimtech science | Kimberly-Clark Professional | 75512 | |||
| O.C.T. compound, mounting medium for cryotomy | VWR Chemicals | 361603E | |||
| Fc block, purified anti-mouse CD16/32, clone 93 | Biolegend | 101302 | Antibody clone and Concentration used: 2.5 mg/ml | ||
| Microscope slides – Superfrost Plus | VWR Chemicals | 631-0108 | |||
| anti-CD169 – AF647 | Biolegend | 142407 | Antibody clone and Concentration used: clone 3D6.112 1.6 mg/ml Excitation wavelength: 650 Emission wavelength: 65 |
||
| anti-F4/80 – APC | Biolegend | 123115 | Antibody clone and Concentration used: clone BM8 2.5 mg/ml Excitation wavelength: 650 Emission wavelength: 660 |
||
| anti-B220 – PB | Biolegend | 103230 | Antibody clone and Concentration used: clone RA3-6B2 1.6 mg/ml Excitation wavelength: 410 Emission wavelength: 455 |
||
| anti-IFNg – biotin | Biolegend | 505804 | Antibody clone and Concentration used: clone XMG1.2 5 mg/ml | ||
| anti-IFNg – BV421 | Biolegend | 505829 | Antibody clone and Concentration used: clone XMG1.2 5 mg/ml Excitation wavelength: 405 Emission wavelength: 436 |
||
| anti-Nkp46/NCRI | R&D Systems | AF2225 | Antibody clone and Concentration used: goat 2.5 mg/ml | ||
| anti-goat IgG-FITC | Novusbio | NPp 1-74814 | Antibody clone and Concentration used: 1 mg/ml Excitation wavelength: 490 Emission wavelength: 525 |
||
| Streptavidin – PE | Biolegend | 405203 | Antibody clone and Concentration used: 2.5 mg/ml Excitation wavelength: 565 Emission wavelength: 578 |
||
| streptavidin – FITC | Biolegend | 405201 | Antibody clone and Concentration used: 2.5 mg/ml Excitation wavelength: 490 Emission wavelength: 525 |
||
| Fluoromount G | SouthernBiotech | 0100-01 | |||
| Cover glasses 22x40mm | Menzel-Glazer | 12352128 | |||
| Liquid blocker super PAP PEN mini | Axxora | CAC-DAI-PAP-S-M | |||
| Imaris – Microscopy Image Analysis Software | Bitplane | ||||
| Confocal microscope – Olympus FV1200 Laser scanning microscope | Olympus | ||||
| Cryostat – CM 1900 UV | Leica | ||||
| Base mould disposable | Fisher Scientific UK Ltd | 11670990 | |||
| PBS 1X | Life Technologies Ltd | 20012068 | |||
| BHI Broth | VWR Brand | 303415ZA | |||
| GFP | Excitation wavelength: 484 Emission wavelength: 507 |
||||
| RFP | Excitation wavelength: 558 Emission wavelength: 583 |
||||
| Insulin syringe, with needle, 29G | VWR International | BDAM324824 | |||
| C57BL/6 wild type mice | Charles River |
References
- Iwasaki, A., Medzhitov, R. Control of adaptive immunity by the innate immune system. Nature Immunology. 16 (4), 343-353 (2015).
- Harty, J. T., Bevan, M. J. Specific immunity to Listeria monocytogenes in the absence of IFN gamma. Immunity. 3 (1), 109-117 (1995).
- Kubota, K., Kadoya, Y. Innate IFN-gamma-producing cells in the spleen of mice early after Listeria monocytogenes infection: importance of microenvironment of the cells involved in the production of innate IFN-gamma. Frontiers in Immunology. 2 (26), (2011).
- Dunn, P. L., North, R. J. Early gamma interferon production by natural killer cells is important in defense against murine listeriosis. Infection and Immunity. 59 (9), 2892-2900 (1991).
- Krummel, M. F., et al. Paracrine costimulation of IFN-gamma signaling by integrins modulates CD8+ T cell differentiation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (45), 11585-11590 (2018).
- Curtsinger, J. M., Agarwal, P., Lins, D. C., Mescher, M. F. Autocrine IFN-gamma promotes naive CD8+ T cell differentiation and synergizes with IFN-alpha to stimulate strong function. Journal of Immunology. 189 (2), 659-668 (2012).
- Hosking, M. P., Flynn, C. T., Whitton, J. L. Antigen-specific naive CD8++ T cells produce a single pulse of IFN-gamma in vivo within hours of infection, but without antiviral effect. Journal of Immunology. 193 (4), 1873-1885 (2014).
- Croxford, A. L., Buch, T. Cytokine reporter mice in immunological research: perspectives and lessons learned. Immunology. 132 (1), 1-8 (2011).
- Gerard, A., et al. Secondary T cell-T cell synaptic interactions drive the differentiation of protective CD8++ T cells. Nature Immunology. 14 (4), 356-363 (2013).
- Engelhardt, J. J., et al. Marginating dendritic cells of the tumor microenvironment cross-present tumor antigens and stably engage tumor-specific T cells. Cancer Cell. 21 (3), 402-417 (2012).
- Matheu, M. P., Cahalan, M. D. Isolation of CD4+ T cells from mouse lymph nodes using Miltenyi MACS purification. Journal of Visualized Experiments. (9), 409 (2007).
- Matheu, M. P., Parker, I., Cahalan, M. D. Dissection and 2-photon imaging of peripheral lymph nodes in mice. Journal of Visualized Experiments. (7), 265 (2007).
- Pope, C., et al. Organ-specific regulation of the CD8+ T cell response to Listeria monocytogenes infection. Journal of Immunology. 166 (5), 3402-3409 (2001).
- Jones, G. S., D’Orazio, S. E. Listeria monocytogenes: cultivation and laboratory maintenance. Current Protocols in Microbiology. 31, 1-7 (2013).
- Kang, S. J., Liang, H. E., Reizis, B., Locksley, R. M. Regulation of hierarchical clustering and activation of innate immune cells by dendritic cells. Immunity. 29 (5), 819-833 (2008).
- Chang, S. R., et al. Characterization of early gamma interferon (IFN-gamma) expression during murine listeriosis: identification of NK1.1+ CD11c+ cells as the primary IFN-gamma-expressing cells. Infection and Immunity. 75 (3), 1167-1176 (2007).
- Mollenhauer, H. H., Morre, D. J., Rowe, L. D. Alteration of intracellular traffic by monensin; mechanism, specificity and relationship to toxicity. Biochimica et Biophysica Acta. 1031 (2), 225-246 (1990).
- Helms, J. B., Rothman, J. E. Inhibition by brefeldin A of a Golgi membrane enzyme that catalyses exchange of guanine nucleotide bound to ARF. Nature. 360 (6402), 352-354 (1992).
- Schuerwegh, A. J., Stevens, W. J., Bridts, C. H., De Clerck, L. S. Evaluation of monensin and brefeldin A for flow cytometric determination of interleukin-1 beta, interleukin-6, and tumor necrosis factor-alpha in monocytes. Cytometry. 46 (3), 172-176 (2001).
- Nylander, S., Kalies, I. Brefeldin A, but not monensin, completely blocks CD69 expression on mouse lymphocytes: efficacy of inhibitors of protein secretion in protocols for intracellular cytokine staining by flow cytometry. Journal of Immunology Methods. 224 (1-2), 69-76 (1999).
