濃縮ヒト記憶B細胞集団からの所望特異性を持つ抗体の選択と回収のための単細胞スクリーニング法
Summary
ヒト末梢血単核細胞から個々の抗原特異的抗体を同定し、回収するBSelex法は、フローサイトメトリーと単一細胞PCRおよびクローニングを組み合わせたものです。
Abstract
ヒト抗体レパートリーは、潜在的な治療抗体および有用なバイオマーカーの大部分が未開拓の供給源を表す。次世代シーケンシング(NGS)などの現在の計算方法は、配列レベルで抗体レパートリーに関する膨大なデータセットを生成する一方で、特定の抗原または一連に関連する配列を特定するために機能的データが必要である。抗原。ここでは、ヒト血液ドナーから末梢血単核細胞(PBMC)から個々の抗原特異的抗体を同定・回収する方法について説明する。この方法は、成熟したB細胞の初期濃縮を利用し、フローサイトメトリーを介してIgGメモリB細胞を単離するために、発眼細胞マーカーと蛍光標識タンパク質の組み合わせを必要とする。重いチェーンと軽鎖の可変領域がクローン化され、再スクリーニングされます。メモリBセルコンパートメントに限定されますが、この方法は、何百万ものB細胞を調知し、発現と特異性の確認の準備が整った形式で単一のセルからペアの重鎖配列と軽鎖配列を返すフローサイトメトリーを利用します。この方法で回収された抗体は、治療の可能性を考慮することができますが、特異性と機能をバイオインフォマティクスアプローチとリンクして、個体内のB細胞レパートリーを評価することもできます。
Introduction
抗体は、治療分子の成長クラスであり、任意のヒトにおける既存のB細胞レパートリーは、そのような抗体の潜在的な供給源である。ヒトドナーから回収された場合、それらは適応または「ヒト化」を必要としない、他の動物系で生成される抗体に必要なステップである。B細胞活性化および増殖1、EBV形質転換2、3、およびハイブリドーマ細胞株の生成を含むヒト抗体の同定および単離のためのいくつかの方法が存在する。 、5.しかし、これらの方法はすべて、抗原特異的抗体をスクリーニングして回収するために広範な細胞培養を必要とします。ヒト抗体レパートリーに関する情報は、次世代シーケンシング(NGS)技術の開発により大幅に拡大され、ドナーサンプル中に存在する大量の個々の配列を同定することが可能となっています。しかし、NGSは存在するすべての配列の非依存的なビューを生み出すので、特に希少または低周波抗体の場合には、抗原特異的抗体の同定および単離を可能にしません。
「BSelex」法の目的は、ヒトドナー中の末梢血単核細胞の循環から抗原特異的抗体を同定し、さらなる分析のためにこれらの抗体の配列を単離して回収することです。この方法は、フローサイトメトリーと細胞選別を利用して、記憶B細胞の表面に発現するB細胞受容体(BCR)を利用する。より低スループットの分子生物学法が開始される前に、何百万ものB細胞をフローサイトメトリーを介して抗原特異性のスクリーニングが可能です。重鎖と軽鎖の組み合わせは、細胞配列を一括で分析するほとんどのNGS法では不可能です。ここで説明する方法では、細胞を個別に単離し、重鎖配列と軽鎖配列の両方のペア回復が可能であり、完全なIgGの直接クローニングおよび発現を可能にする。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここで提示される方法は、フローサイトメトリーと単一細胞クローニングを組み合わせたものであり、ここで説明する方法は、Tillerと同僚によって以前に開発された方法に基づいています11.彼らの研究は、個々の細胞のレベルでヒトのB細胞レパートリーを研究するために、モノクローナル抗体の回収とクローニングについて説明する。我々は、多段階増幅プライマー戦略を含むメモリB細胞の集団からの抗原特異的モノクローナル抗体の回収を可能にするために、そのプロセスの主要な構成要素を適応させた。主な改変は、標識抗原「餌」の添加である。クローニングベクターバックボーンを単一の発現プラスミドに変更する(ただしこれらに限定されない)、生殖細胞系レパートリーの追加プライマーカバレッジ(リーダーシーケンスとフレームワーク1の両方)を含む、公開されたプロトコルに対する追加の適応がなされている。より高い発現のための懸濁液HEK293細胞のトランスフェクション、およびPCR増幅時の高忠実度ポリメラーゼの使用。
ここで説明する方法の場合、最も重要なステップは、フローサイトメトリーと単一細胞クローニングの間の遷移の近くにあります。まず、選別された単一細胞をプレートに適切に配置することが不可欠です。ソーターでドロップディレイを正しく設定することは重要なステップです。ターゲットのソートプレートで静的銃を使用しない限り、回収効率が大幅に低下する可能性があるため、湿度の低さなどの環境要因も考慮する必要があります。細胞の配置に続いて、プレートは、細胞がウェルの底部に10 μLのバッファーに接触していることを確認するために遠心分離されます。これらの対策はすべて、分子生物学の部分が成功するために重要です。単一細胞の逆転転写反応に対して条件が最適でない場合、β-アクチンのPCR増幅が困難でありうる。提示された方法の強さは、何百万もの細胞を尋問し、選択した抗原の抗原に対する抗原反応性基準に一致するもののみをソートする能力です。これには、信号対雑音比を可能な限り高くする必要があり、これはソート前に餌の濃度を最適化することによって行われます。二重標識餌は、蛍心の1つが高い背景を持っている場合に発生する可能性があり、偽陽性細胞の回復を減少させるために使用されます。複数の抗原餌を使用すると、シグナル:ノイズの最適化がより困難になりますが、複数のペプチドを同時に調知する能力は、この方法のもう一つの利点です。
回収効率が低い場合は、一連のネストされたβアクチンプライマーを使用して、テンプレートcDNAが存在することを確認します。このアプローチの欠点は、ウェルに細胞が存在しなかったか、逆転転写反応が失敗したのかを判断することが困難であり、トラブルシューティングが困難である。時折、逆が発生し、効率が予想よりも高くなります。重鎖の典型的な回復は30-45%の間であり、軽鎖は40-60%の間で高い。各PCR反応(ステップI&II)は、単一の細胞から増幅するために50サイクルを使用しています。総サイクル数が多いため、この方法は汚染の影響を受けやすくなります。アンプリコンの配列解析は、汚染物質が導入されたか、または異常に高い回収率が合法的に達成されたかどうかを判断するために使用できます。
選択した抗原に対して天然ヒト抗体を回収するこの方法の有用性には、いくつかの重要な制限がある。第1に、標識可能な可溶性タンパク質のみが、フローサイトメトリーの「餌」として使用されてもよい。代表的な結果に提示された種類については、タンパク質全体を使用することは困難であることが判明したので、タウタンパク質から一連の合成重複ペプチドを使用しました。線形ペプチドの使用は、非線形または構造エピトープに対する抗体の同定を制限する可能性があるため、最適ではない可能性が高い。しかし、我々はタウに対するいくつかのユニークな抗体を同定することができ、これらは現在、さらなる評価8,9を受けている。もう 1 つの制限は、IgG の分子生物学の回復とクローニングの低スループットです。最初のソート戦略は、数百万の細胞のスクリーニングを可能にしますが、その後の分子生物学処理は、複数の段階で構成されています。ギブソンアセンブリ10などの新しいテクノロジーを組み込むための継続的な最適化の取り組みは、いくつかのステップを合理化しましたが、ボトルネックは個々の重鎖と軽鎖のペアのクローンを作成したままです。
「BSelex」法は、記憶B細胞の表面に発現したBCRを利用して抗原反応性を示す細胞を同定し、次いでフローサイトメトリー11、12を介してこれらの個々の細胞を回収する。このBCRへの依存により、この方法はメモリB細胞コンパートメントに限定され、プラズマブラストなどの抗体分泌細胞(ASC)を捕捉しません。しかしながら、このアプローチは、ASCと比較した場合、抗原特異的免疫グロビンのより広いレパートリーを回復するのに有利であり得る。インフルエンザワクチン接種研究は、反応性ASCが少数の膨張B細胞クローンによって支配されうるが、抗原特異的記憶B細胞集団がクローン12を有することはめったにないものを示している。T細胞表面のT細胞受容体(TCR)は、多様性を最大化するために遺伝子配置および組み換えにおいてB細胞受容体と類似性を有する。本書に記載されている方法に記載されているものと同様の単一細胞アプローチは、αおよびβ鎖13の回収および単一細胞クローニングを含むT細胞レパートリーを評価するために開発された。しかし、TCR認識はMHC分子によって提示されるペプチドを必要とし、ペプチド特異的T細胞を同定する標識された餌のアプローチに重要な複雑さを加える。B細胞とは異なり、T細胞は可変領域全体の親和性成熟を受けないため、短いCDR3領域といくつかの側面配列の同定は、同定と再構成に必要なすべてです。最後に、この方法は、フローサイトメトリーを用いたIgG分子の同定を記述するが、異なるアイソタイプのB細胞を同定するために代替表現型マーカーを使用することも可能である。
現在、次世代シーケンシングから収集した膨大なデータを抗原特異性の機能解析と結びつける方法が開発されていますが、その方法は未だ洗練されています。その限界にもかかわらず、ここで説明する方法は、感染性および非感染性疾患8、14、15の両方の潜在的な治療価値を有する抗体を同定するために使用され、信頼性の高いB細胞や広範な細胞培養の広範な操作なしに、ヒトから関連する抗原特異的IgGを回復するためのアプローチ。
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、ルーシー・チャマス、マーサ・コスタ、ジュリー・キム、ナンシー・エレディア、ジェレミー・マセドに、現在のBSelexプラットフォームの多くの方法の変更と改良の広範なテストに感謝したいと思います。
Materials
| MoFlo Astrio EQ, Cell Sorter | MoFlo | cell sorting | |
| Biotinylated peptides | New England Peptide | Cell sorting "bait" | |
| Micro Bio-spin P30 gel column | BioRad | #7326223 | |
| Streptavidin (R-PE) | Thermo Scientific | SA10041 | |
| Streptavidin (APC) | Thermo Scientific | S32362 | |
| CD22 MicroBeads, human | Miltenyi | #130-046-401 | |
| LS columns | Miltenyi | #130-042-401 | |
| Pre separation filters | Miltenyi | #130-041-407 | |
| PerCp-Cy5.5 mouse anti-human CD19 | BD Biosciences | BD#340951 | |
| PE-Cy7 mouse anti-human CD27 | BD Biosciences | #560609 | |
| FITC mouse anti-human IgG | BD Biosciences | #560952 | |
| DAPI | Life Technologies | #D21490 | |
| RNaseOUT | Life Technologies | #10777-019 | |
| Bovine serum albumin, Fraction V | Sigma | #A4503 | |
| RPMI media | Hyclone | #SH30096.01 | |
| HI FBS (Fetal bovine serum) | Invitrogen | #10082147 | |
| Mastercycler Gradient | Eppendorf | Model #6325 | PCR machine |
| PCR 96-well plates | Phenix | MPS-500 | |
| PCR Plate mats | Phenix | SMX-PCR96 | |
| Advantage UltraPure PCR Deoxynucleotide Mix | Clontech | #639125 | |
| Superscript IV First-strand synthesis system | Invitrogen | #18091050 | |
| Phusion High Fidelity Polymerase | Thermo Scientific | F-531-L | |
| Platinum polymerase | Invitrogen | #10966108 | |
| Nuclease-free water | QIAGEN | #129114 | |
| Oligonucleotide primers | IDT | assorted | Primers for all PCR steps |
| Gel Extraction Kit | QIAGEN | #28706 | |
| PCR Purification kit | QIAGEN | #28106 | |
| Miniprep Kit | QIAGEN | #27106 | |
| NEBuilder HiFi DNA Assembly Cloning Kit | New England Biolabs | E5520S | Gibson assembly |
| Expi293 Expression Media | Invitrogen | #A14351-01 | |
| ExpiFectamine 293 Transfection Kit | Invitrogen | #A14525 | |
| Opti-MEM Media | Invitrogen | #31985070 | |
| CO2 incubator (Multitron) | |||
| Octet RED384 System | Pall/ Forte Bio | ||
| Pierce Streptavidin Coated High Binding Capacity Clear 96-well Plates | Thermo Scientific | #15500 | |
| Corning Costar 96-well Polystyrene Plate High Binding Half Area | Corning | #3690 | |
| Goat Anti-human IgG Fab Secondary Antibody | Jackson Labs | #109-036-097 | |
| Goat Anti-mouse HRP Secondary Antibody | Jackson Labs | #115-035-072 | |
| SureBlueTM TMB Microwell Peroxidase Substrate (1-Component) | KPL | #52-00-03 | |
| TMB Stop Solution | KPL | #50-85-06 |
References
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