שיטת הקרנה של תא בודד לבחירת ושחזור של נוגדנים עם הצורך הרצוי מתוך זיכרון אנושי מועשר B אוכלוסיות תאים
Summary
שיטת BSelex כדי לזהות ולשחזר נוגדנים ספציפיים אנטיגן ספציפי של הדם היקפיים היקפי תאים מונמונומנט משלבת הזרימה cy, לנסות עם תא בודד PCR ו שיבוט.
Abstract
הרפרטואר האנושי של הנוגדן מייצג מקור מנוצל ברובו של נוגדנים טיפוליים פוטנציאליים וסמנים שימושיים. בעוד שיטות חישוביות נוכחיות, כגון רצף הדור הבא (NGS), להניב קבוצות עצומות של נתונים על רפרטואר נוגדנים ברמת הרצף, נתונים פונקציונליים נדרש כדי לזהות אילו רצפים רלוונטיים אנטיגן מסוים או קבוצה של אנטיגנים. כאן, אנו מתארים שיטה כדי לזהות ולשחזר נוגדנים ספציפיים אנטיגן ספציפי של דם היקפי תאי מונמונומנט (PBMCs) מתורם דם אנושי. שיטה זו מנצלת העשרה הראשונית של תאים B בוגרת ומחייב שילוב של סמנים תא פנותוניים ו חלבון מתויג בצורה פלואורוסקופים כדי לבודד את זיכרון IgG B תאים באמצעות הזרמת cy, לנסות. אזורי המשתנה הכבד והקל משוכפל ומוקרן מחדש. למרות שהוא מוגבל לזיכרון B תא התא, שיטה זו מנצל את היתרון של cy, מנסה לחקור מיליוני תאים B ומחזיר רצפי שרשרת כבדה וקלה מתא אחד בפורמט מוכן לביטוי ואישור של ספציפיות. נוגדנים ששוחזרו עם שיטה זו יכול להיחשב לפוטנציאל טיפולי, אבל יכול גם לקשר ספציפיות ופונקציה עם גישות ביוטיות כדי להעריך את רפרטואר התא B בתוך יחידים.
Introduction
נוגדנים הם מעמד הולך וגדל של מולקולות טיפוליות, ואת הרפרטואר הקיים של התא B בכל אדם הוא מקור פוטנציאלי של נוגדנים כאלה. כאשר התאושש מתורם אנושי, הם אינם דורשים הסתגלות או “הומניזציה”, צעדים הנדרשים עבור נוגדנים שנוצרו במערכות בעלי חיים אחרים. קיימות מספר שיטות לזיהוי ובידוד של נוגדנים אנושיים, כולל B הפעלת תא והפצת1, הפצה דרך המרת ebv2,3, והדור של קווי יפידים cell4 ,5. עם זאת, כל השיטות הללו דורשות תרבות תא נרחבת למסך ולשחזר נוגדנים ספציפיים אנטיגן. מידע על הרפרטואר לנוגדן האנושי הורחב מאוד עם התפתחות של רצף הדור הבא (NGS) טכנולוגיה, המאפשר זיהוי של כמויות עצומות של רצפים בודדים נוכח דגימות התורם. עם זאת, מכיוון NGS מניב תצוגה אגנוסטי של כל הרצפים נוכח, זה לא מאפשר זיהוי ובידוד של נוגדנים ספציפיים אנטיגן, במיוחד במקרה של נוגדנים בתדר נדיר או נמוך.
מטרתו של “BSelex” השיטה היא לזהות נוגדנים ספציפיים אנטיגן מתוך במחזור דם היקפי תאים מונמונומנט בתורמים אנושיים, ולבודד ולשחזר את רצפי נוגדנים אלה לניתוח נוסף. שיטה זו מנצלת את הזרימה cy, מיון התא כדי לנצל את קולטן התא B (BCR) ביטא על פני השטח של תאי זיכרון B. מיליוני תאים B יכול להיות מוקרן עבור אנטיגן-ספציפיות דרך הזרימה cy, try לפני התפוקה נמוכה יותר ביולוגיה מולקולרית שיטות הם יזמו. לזווג זיהוי שרשרת כבדה ואור אינו אפשרי ברוב שיטות NGS, אשר לנתח רצפי תאים בכמויות גדולות. בשיטה שאנו מתארים כאן, התאים מבודדים בנפרד, ולזווג שחזור הן כבדות ושרשרת האור אפשרי, אשר מאפשר שיבוט ישירה וביטוי של IgG המלא.
Protocol
Representative Results
Discussion
השיטה המוצגת כאן משלבת cy, הזרמת הזרימה ושיבוט תא בודד, ואת השיטות שאנו מתארים כאן אנו מבוססים על שיטות שפותחו בעבר על ידי ההגה ועמיתים11. עבודתם מתארת את ההחלמה והשכפול של נוגדנים חד-שבטיים כדי ללמוד את רפרטואר התא B אצל בני אדם ברמה של תאים בודדים. התאמתי את הרכיבים העיקריים של התהליך שלהם כדי לאפשר שחזור של נוגדנים חד שבטיים ספציפי אנטיגן מאוכלוסיה של תאי זיכרון B, כולל את האסטרטגיה מרובת שלב הגברה. השינוי העיקרי הוא התוספת של “פיתיון” אנטיגן מתויג. עיבודים נוספים נעשו בפרוטוקול שפורסם, כולל (אבל לא מוגבל) שינוי שידרה וקטור שיבוט לתוך ביטוי אחד פלמיד, כיסוי נוסף של הרפרטואר germline (הן רצף מנהיג מסגרת 1), הHEK293 של תאים ההשעיה עבור ביטוי גבוה יותר, ואת השימוש באיכות גבוהה פולימות במהלך הגברה PCR.
עבור השיטות המתוארות כאן, השלבים הקריטיים ביותר הם בקרבת המעבר בין cy, הזרמת הזרימה ושיבוט תא בודד. ראשית, המיקום הנכון של תאים בודדים ממוינים לתוך הלוח הוא חיוני. הגדרת ההשהיה הנפתחת כהלכה בסדרן היא שלב מפתח. גורמים סביבתיים, כגון לחות נמוכה, חייב גם להילקח בחשבון, כפי שגילינו יעילות ההחלמה שלנו ירידה באופן משמעותי, אלא אם כן אקדח סטטי משמש על צלחות מיון היעד. לאחר מיקום התא, צלחות מcentrifuged כדי להבטיח תאים יצרו קשר עם 10 μL של מאגר בחלק התחתון של הבארות. כל האמצעים הללו הם קריטיים להצלחת החלק המולקולרי של הביולוגיה המולקולרית. אם התנאים הם תת אופטימלית עבור התגובה הפוכה התעתיק של תא בודד, הגברה PCR של β-actin יכול להיות קשה. כוחה של השיטה המוצגת היא היכולת לחקור מיליוני תאים ולמיין רק את אלה התואמים את הקריטריונים לפעילות האנטיגן נגד אנטיגן הבחירה. זה דורש את האות ליחס רעש גבוה ככל האפשר, אשר נעשה על ידי אופטימיזציה ריכוזי פיתיון לפני מיון. פיתיון בעל תווית כפולה משמש כדי להפחית את ההתאוששות של תאים שווא-חיוביים, אשר יכול להתרחש אם אחד fluorophores יש רקע גבוה. באמצעות יותר מפיתיון אנטיגן אחד יכול להפוך את האות: מיטוב רעש קשה יותר, אבל היכולת לחקור פפטידים מרובים בו זמנית הוא יתרון נוסף של שיטה זו.
כאשר יעילות השחזור נמוכה, סט של מβ-actin מקונן התחל משמש כדי לאשר את התבנית cDNA קיים. החיסרון בגישה זו הוא כי קשה לקבוע אם לא היה תא מתנה בבאר או תגובת התעתיק הפוכה נכשלה, מה שהופך את פתרון התקלות לקשה. לעיתים, ההיפך יתרחש והיעילות גבוהה מהצפוי. ההתאוששות אופייני עבור שרשרת כבדה היא בין 30-45% ושרשראות אור גבוה יותר, בין 40-60%. כל תגובה PCR (שלב I & II) משתמשת 50 מחזורים כדי להגביר מתא אחד. המספר הגבוה של מחזורים כולל גם הופך שיטה זו חשופה לזיהום. ניתן להשתמש בניתוח רצף של הגברה כדי לקבוע אם הוכנסו מזהם, או ששיעור החלמה גבוה באופן חריג הושג באופן חוקי.
השירות של שיטה זו כדי לשחזר נוגדנים אנושיים מקומיים נגד אנטיגן של בחירה יש כמה מגבלות משמעותיות. ראשית, רק חלבונים מסיסים יכול להיות מתויג יכול לשמש “פיתיון” עבור cy, הזרמת הזרימה. עבור מינים שהוצגו בתוצאות הנציג, השתמשנו סדרה של פפטידים חופפים מסונתז מתוך החלבון של טאו, מאז השימוש בחלבון כולו הוכיחה קשה. השימוש בפפטידים ליניאריים הוא כנראה לא אופטימלי, שכן הוא עשוי להגביל את הזיהוי של נוגדנים נגד אפיסקופים לא ליניאריים או מבניים. עם זאת, הצלחנו לזהות מספר נוגדנים ייחודיים נגד הטאו ואלה עוברים כעת הערכה נוספת8,9. מגבלה נוספת היא תפוקה נמוכה של שחזור ביולוגיה מולקולרית ושיבוט של IgGs. אסטרטגיית המיון הראשונית מאפשרת הקרנת מיליוני תאים, אך העיבוד המולקולרי העוקב מורכב ממספר שלבים. מאמצי אופטימיזציה שוטפת לשלב טכנולוגיות חדשות יותר, כגון האסיפה גיבסון10 יש מספר שלבים מסוימים, אבל צוואר הבקבוק נשאר שיבוט בודדים כבדים שרשרת בהיר זוגות.
השיטה “bselex” מנצל את bcr המבוטא על פני השטח של תאים B זיכרון כדי לזהות תאים המציגים תגובתיות אנטיגן, ולאחר מכן לשחזר את התאים הבודדים באמצעות זרימה cy, מנסה11,12. בשל הסתמכות זו על BCR, השיטה מוגבלת לזיכרון B תא התא, ולא ללכוד הפרשה נוגדנים תאים (ASCs) כגון מחזיק הפלסטיק. עם זאת, גישה זו עשויה להיות יתרון כדי לשחזר רפרטואר רחב יותר של אימונוגלויוגלויויויולים ספציפיים אנטיגן בהשוואה ל-ASCs. מחקרים חיסונים שפעת להפגין כי בעוד ASCs תגובתי יכול להיות נשלט על ידי מספר קטן של שיבוטים המורחבת תא B, הזיכרון הספציפי אנטיגן B האוכלוסייה הנמוכה לעתים נדירות שבטיים12. קולטן תא T (TCR) על פני השטח של תאי T בעל דמיון לקולטן התא B בסידור גנים ושילוב מחדש כדי למקסם את הגיוון. מגישות תאים בודדות בדומה למה שמתואר בשיטה שהוצגה כאן פותחו להערכת רפרטואר התא T, כולל התאוששות ושכפול תא בודד של רשתות אלפא וביתא13. עם זאת, זיהוי TCR דורש פפטידים להיות מוצגים על ידי מולקולות MHC, הוספת מורכבות משמעותית לגישת פיתיון בתווית כדי לזהות תאי T ספציפיים פפטיד. בשונה מתאים B, תאי T אינם עוברים בגרות אהדה של אזור המשתנה כולו, כך שזיהוי האזור הקצר CDR3 וחלק מהרצף הוא כל מה שנדרש לזיהוי ולחוקה מחדש. לבסוף, שיטה זו מתארת את הזיהוי של מולקולות IgG באמצעות הזרימה cy, אבל זה אפשרי גם להשתמש סמנים פנוטיפים חלופיים כדי לזהות תאים B של איזוסוגים שונים.
כיום, ישנן שיטות שפותחו כדי לחבר את הכמות העצומה של הנתונים שנאספו מרצף הדור הבא עם ניתוח פונקציונלי של ספציפיות אנטיגן, אבל שיטות אלה עדיין להיות מעודן. למרות מגבלותיו, השיטה המתוארת כאן שימש לזיהוי נוגדנים עם ערך תרפויטי פוטנציאלי למחלות זיהומיות ומחלות שאינן זיהומיות8,14,15, ומייצגת מהימנות גישה לשחזר את האיגים הרלוונטיים אנטיגן ספציפיים מבני אדם, ללא מניפולציה נרחבת של תאים B או תרבות תא נרחבת.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים רוצים להודות ללוסי צ’אממאס, מרתה קוסטה, ג’ולי קים, ננסי ארדיה, ויורם מקאדו עבור בדיקות נרחבות של שינויי שיטה רבים ועידון של פלטפורמת BSelex הנוכחית.
Materials
| MoFlo Astrio EQ, Cell Sorter | MoFlo | cell sorting | |
| Biotinylated peptides | New England Peptide | Cell sorting "bait" | |
| Micro Bio-spin P30 gel column | BioRad | #7326223 | |
| Streptavidin (R-PE) | Thermo Scientific | SA10041 | |
| Streptavidin (APC) | Thermo Scientific | S32362 | |
| CD22 MicroBeads, human | Miltenyi | #130-046-401 | |
| LS columns | Miltenyi | #130-042-401 | |
| Pre separation filters | Miltenyi | #130-041-407 | |
| PerCp-Cy5.5 mouse anti-human CD19 | BD Biosciences | BD#340951 | |
| PE-Cy7 mouse anti-human CD27 | BD Biosciences | #560609 | |
| FITC mouse anti-human IgG | BD Biosciences | #560952 | |
| DAPI | Life Technologies | #D21490 | |
| RNaseOUT | Life Technologies | #10777-019 | |
| Bovine serum albumin, Fraction V | Sigma | #A4503 | |
| RPMI media | Hyclone | #SH30096.01 | |
| HI FBS (Fetal bovine serum) | Invitrogen | #10082147 | |
| Mastercycler Gradient | Eppendorf | Model #6325 | PCR machine |
| PCR 96-well plates | Phenix | MPS-500 | |
| PCR Plate mats | Phenix | SMX-PCR96 | |
| Advantage UltraPure PCR Deoxynucleotide Mix | Clontech | #639125 | |
| Superscript IV First-strand synthesis system | Invitrogen | #18091050 | |
| Phusion High Fidelity Polymerase | Thermo Scientific | F-531-L | |
| Platinum polymerase | Invitrogen | #10966108 | |
| Nuclease-free water | QIAGEN | #129114 | |
| Oligonucleotide primers | IDT | assorted | Primers for all PCR steps |
| Gel Extraction Kit | QIAGEN | #28706 | |
| PCR Purification kit | QIAGEN | #28106 | |
| Miniprep Kit | QIAGEN | #27106 | |
| NEBuilder HiFi DNA Assembly Cloning Kit | New England Biolabs | E5520S | Gibson assembly |
| Expi293 Expression Media | Invitrogen | #A14351-01 | |
| ExpiFectamine 293 Transfection Kit | Invitrogen | #A14525 | |
| Opti-MEM Media | Invitrogen | #31985070 | |
| CO2 incubator (Multitron) | |||
| Octet RED384 System | Pall/ Forte Bio | ||
| Pierce Streptavidin Coated High Binding Capacity Clear 96-well Plates | Thermo Scientific | #15500 | |
| Corning Costar 96-well Polystyrene Plate High Binding Half Area | Corning | #3690 | |
| Goat Anti-human IgG Fab Secondary Antibody | Jackson Labs | #109-036-097 | |
| Goat Anti-mouse HRP Secondary Antibody | Jackson Labs | #115-035-072 | |
| SureBlueTM TMB Microwell Peroxidase Substrate (1-Component) | KPL | #52-00-03 | |
| TMB Stop Solution | KPL | #50-85-06 |
References
- Su, K. Y., Watanabe, A., Yeh, C. H., Kelsoe, G., Kuraoka, M. Efficient Culture of Human Naive and Memory B Cells for Use as APCs. Journal of Immunology. 197 (10), 4163-4176 (2016).
- Corti, D., Lanzavecchia, A. Broadly neutralizing antiviral antibodies. Annual Review of Immunology. 31, 705-742 (2013).
- Steinitz, M., Klein, G., Koskimies, S., Makel, O. EB virus-induced B lymphocyte cell lines producing specific antibody. Nature. 269 (5627), 420-422 (1977).
- Bloom, A. D., Nakamura, F. T. Establishment of a tetraploid, immunoglobulin-producing cell line from the hybridization of two human lymphocyte lines. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 71 (7), 2689-2692 (1974).
- Olsson, L., Kaplan, H. S. Human-human hybridomas producing monoclonal antibodies of predefined antigenic specificity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 77 (9), 5429-5431 (1980).
- Lechner, J., et al. Alterations in Circulating Immune Cells in Neovascular Age-Related Macular Degeneration. Scientific Reports. 5, 16754 (2015).
- Loken, M. R., Brosnan, J. M., Bach, B. A., Ault, K. A. Establishing optimal lymphocyte gates for immunophenotyping by flow cytometry. Cytometry. 11 (4), 453-459 (1990).
- Pascual, G., et al. Immunological memory to hyperphosphorylated tau in asymptomatic individuals. Acta Neuropathologica. 133 (5), 767-783 (2017).
- van Ameijde, J., et al. Enhancement of therapeutic potential of a naturally occurring human antibody targeting a phosphorylated Ser(422) containing epitope on pathological tau. Acta Neuropathologica Communications. 6 (1), 59 (2018).
- Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- Tiller, T., et al. Efficient generation of monoclonal antibodies from single human B cells by single cell RT-PCR and expression vector cloning. Journal of Immunological Methods. 329 (1-2), 112-124 (2008).
- Wrammert, J., et al. Rapid cloning of high-affinity human monoclonal antibodies against influenza virus. Nature. 453 (7195), 667-671 (2008).
- Han, A., Glanville, J., Hansmann, L., Davis, M. M. Linking T-cell receptor sequence to functional phenotype at the single-cell level. Nature Biotechnology. 32 (7), 684-692 (2014).
- Apetri, A., et al. A common antigenic motif recognized by naturally occurring human VH5-51/VL4-1 anti-tau antibodies with distinct functionalities. Acta Neuropathologica Communications. 6 (1), 43 (2018).
- Jones, H. G., et al. Structural basis for recognition of the central conserved region of RSV G by neutralizing human antibodies. PLoS Pathogens. 14 (3), 1006935 (2018).
- . . US patent. , (2017).
