从富足人类记忆B细胞群中选择和恢复具有所需特异性的抗体的单细胞筛选方法

使用人类志愿者的样本遵循了斯克里普斯研究所机构审查委员会批准的协议。献血前征得献血者知情同意。 1. 试剂制备 外周血单核细胞 通过Ficoll-Plaque Plus分离，从正常人类捐献者中恢复外周血单核细胞。在90%胎儿牛血清（FBS）和10%二甲基亚硫酸盐（DMSO）中，在5000万细胞/mL下冷冻保存。将细胞冷冻在-80°C，并转移到液氮中长期储存。 标记目标抗原肽进行分拣 使用终端生物锡生成或获得特定靶蛋白的肽（长达 70 个残留物）。 标签 4 nmol 每个单独的生物素化肽与链球蛋白共价附着在PE （R-phycoeryrin） 或APC （过敏素青霉素） 在单独的管中。使用9：1肽与链球菌蛋白（SA）的摩尔比制备，最终浓度约为3.2 μM，用于SA-PE和5.7 μM SA-APC。准备生物锡四联体作为负控制。 在4°C下，在黑暗中孵育每个肽混合物，缓慢混合。 通过含有聚丙烯酰胺珠子的微柱，去除未结合的荧光酸。 在4°C下储存肽四联体长达2个月。 2. 单元格排序 在CD22+隔离前至少1小时至16小时，解冻供体PBMC，并在37°C下休息。 从冰箱中取出冷冻的PBMC小瓶，并立即转移到37°C的水浴中。当小瓶几乎解冻时，转移到工作区。 将每个小瓶的含量转移到含有预热介质的50 mL管中（保持捐赠者分开）。将介质添加到 50 mL 的最终体积中。轻轻地混合内容。 在室温下以 370 x g离心 6 分钟。丢弃上清液，将细胞重新悬浮在 15 mL 的 RPMI 完整培养基中，并执行细胞计数。 使用 RPMI 完整培养基将细胞浓度调整到 2.0 x 107细胞/mL，并将细胞转移到 T75 烧瓶或更大，并在 37°C 孵育至少 1 小时和 16 小时，以便解冻细胞的恢复时间。 收集细胞（如果需要，汇集），在370 x g下在4°C下6分钟。丢弃上清液，在5 mL的冷MACS缓冲液（PBS，pH 7.6含有0.5%BSA和2 mM EDTA）中重新悬浮细胞，使用MACS缓冲液将细胞量提高到50 mL，并执行细胞计数。 在4°C下将细胞在400 x g下离心7分钟。 通过在CD22微珠上捕获，通过正选择分离CD22+B细胞。使用 MACS 缓冲液进行所有扫描。在 4°C 下计数和离心 400 x g 7 分钟。预期恢复率为PBMC总人口的5-10%。 以每mL FACS缓冲液4000万的悬浮细胞（Tris缓冲液，pH 8.0含有0.5%BSA和2 mM EDTA），并继续单独或作为池对捐赠者进行细胞染色。 用于记忆 B 细胞排序的染色细胞 移除用于细胞仪设置的细胞的等分，并补偿所使用的每个标记荧光道。将未染色的单元格作为控件。 计算获得的 CD22+细胞数的最终染色量（每 100 μL 染色 2 百万）。 根据制造商的稀释建议，为 B 细胞 （CD19-PerCP-Cy5.5）、IgG （IgG-FITC） 和存储室 （CD27-PECy7） 添加细胞外标记，并轻轻混合。将107个细胞放入1.5 mL管中进行负控制，并将剩余的细胞转移到15 mL管中。 将双标记生物素-SA四联体添加到负控制管中，最终浓度为 36 nM，PE 和 APC 乘以 SORT 管中的肽数，并通过 FACS 缓冲液（例如，10 个肽 x 36 nM=360 nM）将体积最终达到 0.5 mL。 将肽四联体加入PE和APC各36 nM的分拣管中，使用TBS缓冲液将细胞达到每100μL2x10 6。在黑暗中在4°C下孵育，温和旋转30-60分钟。 在4°C下洗2次，400 x g，7分钟，在最后一次洗涤前去除一个等分计数。使用 5 mL 滤帽管过滤电池。在分类之前将DAPI（4’，6-diamidino-2-phenylindole）染色添加到0.3 μM最终浓度中，作为细胞膜完整性的标志。 通过流式细胞测定进行单细胞分拣 准备 48 口 96 孔 PCR 板的孔进行分拣。 准备主混合物：每个样品（2 μL的10倍RT缓冲液，0.5μL的RNase抑制剂，7.5μL的无菌PCR级水）。每口井的10μL，盖上盖子，并储存在4°C，直到准备排序。 在单元分拣机上运行负控制，分析整个样本。 设置流式细胞测量门，以分离用于单细胞分选的相应细胞群。 绘制 FSC 区域与 SSC 区域，并将门 R1 设置为隔离淋巴细胞。 绘制 FSC 高度与 FSC 宽度，并将门 R3 设置为排除 FSC 双精度值。 绘制 SSC 高度与 SSC 宽度，并将门 R4 设置为排除 SSC 双精度值。 绘制 SSC 高度 vs DAPI 并设置门 R5 以隔离活细胞 （DAPI-）。 图 IgG vs CD19 并设置门 R6 以隔离 IgG+ B 细胞 （CD19+ IgG+）。 绘制 IgG vs CD27 并设置门 R7 以选择内存 B 单元 （CD27高）。 绘制抗原-PE （Ag-PE） 与抗原-APC （Ag-APC），并将门 R8 设置为 Ag-PE +/Ag-APC+象限，双正门中事件数量少。 从抗原阳性（Ag+）样本中收集相同数量的内存细胞，以测定噪声信号。 将具有表型 CD19+ CD27+ Ag-PE+ Ag-APC+ （门 R8） 的单细胞分类到准备好的 96 孔 PCR 板中。 盖板与铝胶带垫，离心机1分钟，在400 x g，并储存在-80°C为未来的克隆。 3. 单细胞克隆 逆转录反应 从 80°C 中取出单个 B 细胞分拣板。在冰上解冻 2 分钟，在 3，300 x g下将板旋转 2 分钟，在打开之前将内容物汇集在井底。 准备一个dNTP/缓冲主混合物，以10%非离子洗涤剂和寡果（dT）作为反向底漆。加入酶混合到每个井包含单个细胞和不要混合。 在65°C下孵育5分钟。加入含有100mM DTT、RNase抑制剂和逆转录酶的酶主混合物，使总体积达到20μL。在50°C孵育10分钟，在80°C下孵育10分钟。 在开始 PCR 步骤之前转移到冰上 多步嵌套 PCR 反应 使用单独的嵌套 PCR 反应用于重链 （HC） 和轻链 （LC） 放大。 对于第一轮PCR扩增（步骤I），使用前引基和单个反向引水器池在单独的PCR反应中放大HC和LC可变区域（图2）。根据设计，前引体池将放大很大比例的生殖系引线（L）序列，反向引基特定于每个链的下游常量区域，包括光链16的kappa（+）和lambda（μ）。 使用 2.5 μL 的 cDNA 产物作为每个 PCR（步骤 I） 反应的模板。将引力添加到每个反应浓度为1μM的最终反应浓度中。将10倍聚合酶缓冲液加倍至2倍浓度，使最终体积达到每次反应25μL。使用 [94 °C/4 分钟;94°C /15 s、55 °C /20 s、68 °C/60 s;68°C/3 分钟] 运行 HC PCR 反应，进行 50 个循环。使用 [98 °C/4 分钟;98°C /15 s、72 °C /20 s、72 °C/60 s;72 °C/3 分钟] 运行 LC PCR 反应，进行 50 个循环。 使用步骤 I 产品的 2.5 μL 作为每个（步骤 II） PCR 反应的模板。加入特定于HC和LC（+和+）框架1区域的正向引物池，以及特定于每个抗体链的结区域的反向引物池。将10倍聚合酶缓冲液加倍至2倍浓度，并使用与步骤I相同的参数运行PCR反应50个周期。 在1%的甘蔗凝胶上运行已完成的PCR反应，以可视化正扩增命中。从同一细胞中恢复成对的放大器（重链和轻链），并通过凝胶提取进行分离。通过 OD260确定 DNA 片段浓度，以便进行准确的结扎混合计算。 使用商业试剂盒使用4片结扎反应，将回收的重链和轻链片段与链接器片段和表达向量主干相结合。 使用商业试剂盒将结扎反应转化为具有化学能力的细菌。一旦在抗生素板上镀上，在剩余的转化培养基中加入4 mL的生长介质（使用抗生素），并在250rpm下孵育37°C过夜。这就是”结扎混合文化”。 使用商业试剂盒从隔夜结扎混合培养物制备微型DNA，并确定产生的质粒DNA浓度。 4. ELISA屏幕确认抗原特异性 用阳离子脂基试剂将10μg的微型制备DNA转染成10mL的悬浮293细胞，在37°C（8%CO 2）下孵育3-4天，同时以125rpm旋转。对于收获，离心机培养10分钟在1000 x g和回收澄清介质。 通过与蛋白质 A 的亲和力测量上生子中的 IgG 浓度。 通过酶链接吸附测定（ELISA）对用于该排序的单个肽（在链球菌蛋白板上捕获或作为阴性对照物的活性剂）测试每个IgG（在上清液中）。使用山羊抗人过氧化物酶二级抗体对抗人类IgG Fab检测重组克隆。减去背景后，OD > 0.5 被定义为屏幕正极。 通过执行额外的 ELISA，使用 IgG 上清液稀释产生从每 mL 20 μg 开始的浓度曲线，以及针对初始屏幕 ELISA 中显示反应性的每个抗原针对 OD 绘制图解，确认屏幕正命中数。