JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Biochimie

Uso do elemento Alu contendo Minigenes para analisar RNAs circulares

Published: March 10, 2020
doi:
10.3791/59760
, , ,
1Institute for Molecular and Cellular Biochemistry,University of Kentucky

Summary

Clonamos e analisamos genes de repórteres gerando RNAs circulares. Esses genes de repórter são maiores do que construções para analisar emendas lineares e conter elementos Alu. Para investigar os RNAs circulares, os construtos são transfeccionados em células e o RNA resultante é analisado usando RT-PCR após a remoção do RNA linear.

Abstract

Além de mRNAs lineares, muitos genes eucaticos geram RNAs circulares. A maioria das RNAs circulares são geradas juntando-se a um site de emenda de 5′ com um site de emenda upstream 3′ dentro de um pré-mRNA, um processo chamado back-splicing. Essa circularização é provavelmente auxiliada por estruturas secundárias no pré-mRNA que aproximam os locais de junção. Nos genes humanos, os elementos alu são pensados para promover essas estruturas secundárias de RNA, pois os elementos alu são abundantes e exibem complementaridades de base uns com os outros quando presentes em direções opostas no pré-mRNA. Aqui, descrevemos a geração e análise de grandes elementos Alu contendo genes de repórteres que formam RNAs circulares. Através da otimização dos protocolos de clonagem, genes de repórter com comprimento de inserção de até 20 kb podem ser gerados. Sua análise em experimentos de cofecção permite a identificação de fatores regulatórios. Assim, este método pode identificar seqüências de RNA e componentes celulares envolvidos na formação de RNA circular.

Introduction

RNAs Circulares
As RNAs circulares (circRNAs) são RNAs univalentemente fechadas que são expressas na maioria dos organismos. Eles são gerados juntando um site de emenda downstream 5′ a um site de emendas upstream 3′, um processo chamado back-splicing(Figura 1A)1. Seqüências no pré-mRNA que exibem base complementar tão curta quanto 30-40 nt trazem locais de back-splice em alinhamento adequado para formação de cirrna2. Em humanos, os elementos Alu 1, representando cerca de 11% do genoma3, formam extensas estruturas de RNA duplamente encalhadas em pré-mRNA devido à sua auto-complementaridade4,5 e, assim, promovem a formação de cirrnas1.

Atualmente, três principais funções de cirrnas foram descritas. Algumas circRNAs ligam microRNAs (miRNAs) e através de atos de sequestro como esponjas miRNA6. CircRNAs foram implicadas na regulação transcricional e pós-transcricional, por meio de competição com emenda linear7 ou modulação da atividade do fator de transcrição8. Por fim, as cirrnas contêm quadros curtos de leitura abertas e a prova de estudos de princípio mostram que podem ser traduzidos9,10. No entanto, a função da maioria das cirrnas permanece enigmática. A maioria das RNAs circulares foram detectadas usando métodos de seqüenciamento de última geração11. Análises detalhadas de genes individuais usando abordagens RT-PCR direcionadas revelam que um grande número de RNAs circulares continua a ser descoberto12.

Uso de genes de repórteres para analisar o processamento pré-mRNA
A análise do mRNA derivado do DNA que o repórter constrói transfeccionado em células é um método bem estabelecido para estudar emendas alternativas pré-mRNA, que podem ser aplicadas a RNAs circulares. Em geral, o éon alternativo, seus íntrons circundantes e exons constitutivos são amplificados e clonados em um vetor de expressão eucariótica. Freqüentemente, os íntrons são encurtados. Os construtos são transfeccionados em células eucarióticas e geralmente analisados por RT-PCR13,14. Esta abordagem tem sido amplamente utilizada para mapear sites de emendas regulatórias e fatores transadores em experimentos de cofecção13,15,16,17,18. Além disso, a geração de minigenes que expressam proteínas permitiu a triagem de substâncias que alteram emendas alternativas19,20.

O método foi aplicado a RNAs circulares. Atualmente, pelo menos 12 backbones minigenes foram descritos na literatura e estão resumidos na Tabela 1. Com exceção do sistema de expressão baseado em tRNA21,22, todos eles são dependentes de promotores de polimerase II. Aqui, descrevemos um método para gerar minigenes de repórteres humanos para determinar fatores cis e transativos envolvidos na geração de RNAs circulares. Uma visão geral do método usando seqüências de um gene de repórter publicado23 é mostrada na Figura 1.

Protocol

1. Projeto das construções Use o navegador de genoma UCSC24 para identificar elementos repetitivos necessários para a formação de RNA circular e incorporá-los nos construtos. É importante ressaltar que os primers para amplificação precisam estar fora dos elementos repetitivos. Cole a seqüência circular de RNA(Figura Suplementar 1 é uma seqüência de teste) em https://gen…

Representative Results

Os genes dos repórteres permitem determinar fatores regulatórios que influenciam a formação circular de RNA. No entanto, esses genes de repórteres são grandes e contêm elementos repetitivos que muitas vezes tornam construções de DNA instáveis. Devido ao seu grande tamanho, muitas vezes é necessário excluir partes dos íntrons, o que é conseguido amplificando peças genômicas contendo os éons e partes menores de flanqueamento intrônico. Essas peças de DNA são montadas enzimáticamente, permitindo a const…

Discussion

Em geral, as RNAs circulares são baixas abundantes1, o que complica o estudo de sua função e formação. Semelhante às RNAs lineares13, o uso de minigenes repórter permite a identificação de fatores cis e trans-atuação que regulam a formação de RNAs circulares. Assim, essa abordagem gera hipóteses que podem ser ainda mais testadas usando os genes endógenos.

O passo mais crítico é o design do gene do repórter. A montagem enzimátic…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado pelo Departamento de Defesa DoD conceder AZ180075. Stefan Stamm agradece jacqueline Noonan Endowment. Anna Pawluchin foi apoiada pelo DAAD, programa alemão de intercâmbio acadêmico, Justin R. Welden recebeu o Prêmio Da Universidade de Kentucky Max Steckler.

Materials

(PEI) Hydrochloride Polysciences 24765-1
Builder tool NEB https://nebuilder.neb.com/#!/
Dark Reader Transilluminator. Clare Chemical Research
Enzymatic DNA assembly kit NEB E2621S
Gel and PCR cleanup kit Promega A9282
Glyco Blue Thermo Fisher AM9516
pcDNA3.1 cloning site Polycloning site https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/pcdna3_1_man.pdf
Polymerase 1 NEB M0491L Q5 DNA polymerase
Polymerase 2 Biorad 1725310 Long range polymerase (NEB), iproof (BioRad)
Polymerase 2 Qiagen 206402 Qiagen long range polymerase kit
Reverse Transcriptase Thermo Fisher 18080044
RNA isolation kit Life Technologies 12183025 Ambion by Life Technologies
RNAse R Lucigen RNR07250 Epicenter/Lucigen
Stable competent cells NEB C3040H NEB stable cells
Standard cloning bacteria NEB C2988J NEB5-alpha competent
Web tool to design primers NEB https://nebuilder.neb.com/#!/
Web-based temperature calculations NEB https://tmcalculator.neb.com/#!/main
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jeck, W. R., et al. Circular RNAs are abundant, conserved, and associated with ALU repeats. RNA. 19 (2), 141-157 (2013).
  2. Zhang, X. O., et al. Complementary sequence-mediated exon circularization. Cell. 159 (1), 134-147 (2014).
  3. Deininger, P. Alu elements: know the SINEs. Genome Biology. 12 (12), 236 (2011).
  4. Bazak, L., Levanon, E. Y., Eisenberg, E. Genome-wide analysis of Alu editability. Nucleic Acids Research. 42 (11), 6876-6884 (2014).
  5. Levanon, E. Y., et al. Systematic identification of abundant A-to-I editing sites in the human transcriptome. Nature Biotechnology. 22 (8), 1001-1005 (2004).
  6. Hansen, T. B., et al. Natural RNA circles function as efficient microRNA sponges. Nature. 495 (7441), 384-388 (2013).
  7. Kelly, S., Greenman, C., Cook, P. R., Papantonis, A. Exon Skipping Is Correlated with Exon Circularization. Journal of Molecular Biology. 427 (15), 2414-2417 (2015).
  8. Li, Z., et al. Exon-intron circular RNAs regulate transcription in the nucleus. Nature Structural & Molecular Biology. 22 (3), 256-264 (2015).
  9. Yang, Y., et al. Extensive translation of circular RNAs driven by N(6)-methyladenosine. Cell Research. 27 (6), 626-641 (2017).
  10. Abe, N., et al. Rolling Circle Translation of Circular RNA in Living Human Cells. Scientific Reports. 5, 16435 (2015).
  11. Salzman, J., Chen, R. E., Olsen, M. N., Wang, P. L., Brown, P. O. Cell-type specific features of circular RNA expression. PLOS Genetics. 9 (9), 1003777 (2013).
  12. Ottesen, E. W., Luo, D., Seo, J., Singh, N. N., Singh, R. N. Human Survival Motor Neuron genes generate a vast repertoire of circular RNAs. Nucleic Acids Research. 47 (6), 2884-2905 (2019).
  13. Stoss, O., Stoilov, P., Hartmann, A. M., Nayler, O., Stamm, S. The in vivo minigene approach to analyze tissue-specific splicing. Brain Research Protocols. 4, 383-394 (1999).
  14. Mardon, H. J., Sebastio, G., Baralle, F. E. A role for exon sequences in alternative splicing of the human fibronectin gene. Nucleic Acids Research. 15, 7725-7733 (1987).
  15. Gaildrat, P., et al. Use of splicing reporter minigene assay to evaluate the effect on splicing of unclassified genetic variants. Methods in Molecular Biology. 653, 249-257 (2010).
  16. Cooper, T. A. Use of minigene systems to dissect alternative splicing elements. Methods. 37 (4), 331-340 (2005).
  17. Baralle, D., Baralle, M. Splicing in action: assessing disease causing sequence changes. Journal of Medical Genetics. 42 (10), 737-748 (2005).
  18. Percifield, R., Murphy, D., Stoilov, P. Medium throughput analysis of alternative splicing by fluorescently labeled RT-PCR. Methods in Molecular Biology. 1126, 299-313 (2014).
  19. Stoilov, P., Lin, C. H., Damoiseaux, R., Nikolic, J., Black, D. L. A high-throughput screening strategy identifies cardiotonic steroids as alternative splicing modulators. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (32), 11218-11223 (2008).
  20. Shen, M., et al. Pyrvinium pamoate changes alternative splicing of the serotonin receptor 2C by influencing its RNA structure. Nucleic Acids Research. 41 (6), 3819-3832 (2013).
  21. Noto, J. J., Schmidt, C. A., Matera, A. G. Engineering and expressing circular RNAs via tRNA splicing. RNA Biology. , 1-7 (2017).
  22. Schmidt, C. A., Noto, J. J., Filonov, G. S., Matera, A. G. A Method for Expressing and Imaging Abundant, Stable, Circular RNAs In Vivo Using tRNA Splicing. Methods in Enzymology. 572, 215-236 (2016).
  23. Welden, J. R., van Doorn, J., Nelson, P. T., Stamm, S. The human MAPT locus generates circular RNAs. Biochimica et Biophysica Acta – Molecular Basis of Disease. , 2753-2760 (2018).
  24. Casper, J., et al. The UCSC Genome Browser database: 2018 update. Nucleic Acids Research. 46, 762-769 (2018).
  25. Grozdanov, P. N., MacDonald, C. C. Generation of plasmid vectors expressing FLAG-tagged proteins under the regulation of human elongation factor-1alpha promoter using Gibson assembly. Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).
  26. Wang, Y., et al. A novel strategy to engineer DNA polymerases for enhanced processivity and improved performance in vitro. Nucleic Acids Research. 32 (3), 1197-1207 (2004).
  27. Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
  28. Conn, S. J., et al. The RNA binding protein quaking regulates formation of circRNAs. Cell. 160 (6), 1125-1134 (2015).
  29. Jeck, W. R., Sharpless, N. E. Detecting and characterizing circular RNAs. Nature Biotechnology. 32 (5), 453-461 (2014).
  30. Pamudurti, N. R., et al. Translation of CircRNAs. Molecular Cell. 66 (1), 9-21 (2017).
  31. Kramer, M. C., et al. Combinatorial control of Drosophila circular RNA expression by intronic repeats, hnRNPs, and SR proteins. Genes & Development. 29 (20), 2168-2182 (2015).
  32. Starke, S., et al. Exon circularization requires canonical splice signals. Cell Reports. 10 (1), 103-111 (2015).
  33. Suzuki, H., Tsukahara, T. A view of pre-mRNA splicing from RNase R resistant RNAs. International Journal of Molecular Sciences. 15 (6), 9331-9342 (2014).
  34. Zhang, X. O., et al. Diverse alternative back-splicing and alternative splicing landscape of circular RNAs. Genome Research. 26 (9), 1277-1287 (2016).
  35. Liang, D., Wilusz, J. E. Short intronic repeat sequences facilitate circular RNA production. Genes & Development. 28 (20), 2233-2247 (2014).
  36. Wang, Y., Mandelkow, E. Tau in physiology and pathology. Nature Reviews Neuroscience. 17 (1), 5-21 (2016).
  37. Fejes-Toth, K., et al. Post-transcriptional processing generates a diversity of 5′-modified long and short RNAs. Nature. 457 (7232), 1028-1032 (2009).
  38. Gao, Q. S., et al. Complex regulation of tau exon 10, whose missplicing causes frontotemporal dementia. Journal of Neurochemistry. 74 (2), 490-500 (2000).
  39. Hartmann, A. M., et al. Regulation of alternative splicing of human tau exon 10 by phosphorylation of splicing factors. Molecular and Cellular Neuroscience. 18 (1), 80-90 (2001).
  40. Wang, Y., Wang, Z. Efficient backsplicing produces translatable circular mRNAs. RNA. 21 (2), 172-179 (2015).
  41. Yang, Y., Wang, Z. Constructing GFP-Based Reporter to Study Back Splicing and Translation of Circular RNA. Methods in Molecular Biology. 1724, 107-118 (2018).
  42. Zheng, Q., et al. Circular RNA profiling reveals an abundant circHIPK3 that regulates cell growth by sponging multiple miRNAs. Nature Communications. 7, 11215 (2016).
  43. Jia, W., Xu, B., Wu, J. Circular RNA expression profiles of mouse ovaries during postnatal development and the function of circular RNA epidermal growth factor receptor in granulosa cells. Metabolism. 85, 192-204 (2018).
  44. Liang, D., et al. The Output of Protein-Coding Genes Shifts to Circular RNAs When the Pre-mRNA Processing Machinery Is Limiting. Molecular Cell. 68 (5), 940-954 (2017).
  45. Legnini, I., et al. Circ-ZNF609 Is a Circular RNA that Can Be Translated and Functions in Myogenesis. Molecular Cell. 66 (1), 22-37 (2017).
  46. Li, X., et al. Coordinated circRNA Biogenesis and Function with NF90/NF110 in Viral Infection. Molecular Cell. 67 (2), 214-227 (2017).
  47. Zhang, Y., et al. The Biogenesis of Nascent Circular RNAs. Cell Reports. 15 (3), 611-624 (2016).

Tags

Circular RNAAlternative SplicingGenomic Expression SystemAlu ElementPCR OptimizationUCSC Genome BrowserRepetitive ElementsPrimer DesignExon-intron BordersReverse Complement

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Welden, J. R., Pawluchin, A., van Doorn, J., Stamm, S. Use of Alu Element Containing Minigenes to Analyze Circular RNAs. J. Vis. Exp. (157), e59760, doi:10.3791/59760 (2020).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image