円形RNA解析に対する小遺伝子を含むAlu要素の使用

円形のRNA
円形RNA(circRNA)は、ほとんどの生物で発現される共有閉鎖単一鎖RNAである。これらは、ダウンストリームの 5′ スプライス サイトをアップストリーム 3′ スプライス サイトに結合することによって生成されます。30-40 ntと短い相補的な塩基を示すプレmRNA中の配列は、circRNA形成²のための適切なアライメントにバックスプライス部位を持ち込む。ヒトにおいて、Alu要素¹は、ゲノム³の約11%を表し、自己相補性^4、5によるmRNA前に広範な二本鎖RNA構造を形成し^、circRNA1の形成を促進する。

現在、circRNAの3つの主要な機能が説明されている。いくつかのcircRNAはマイクロRNA(miRNA)を結合し、隔離を通じてmiRNAスポンジ⁶のように作用する。CircRNAは、転写および転写後の調節に関与しており、線形スプライシング⁷または転写因子活性の変調との競合を通じて^8.最後に、circRNAは短いオープンリーディングフレームを含み、原理研究の証明は、それらが^9、10を翻訳できることを示しています。しかし、ほとんどのcircRNAの機能は謎のままです。循環RNAの大部分は、次世代シーケンシング方法¹¹を使用して検出された。標的RT-PCR法を用いた個々の遺伝子の詳細な分析により、多数の円形RNAが未発見のまま¹²が発見される。

レポーター遺伝子を用い、mRNA前処理を解析
細胞にトランスフェクトされたDNAレポーター構築物由来のmRNAの分析は、円形RNAに適用できる代替プレmRNAスプライシングを研究するための確立された方法です。一般に、代替エキソン、その周囲のイントロン、および構成エキソンは、真核生物発現ベクターに増幅およびクローン化される。多くの場合、イントロンは短くされます。この構成体は真核細胞にトランスフェクトされ、通常RT-PCR^13,14によって分析される。このアプローチは、共トランスフェクション実験13、15、16、17、18における規制スプライス部位とトランス作用因子をマッピングするために広く使用されています。また、タンパク質発現ミニ遺伝子の生成により、代替スプライシングを変化させる物質のスクリーニング^{が可能な19,20.}

このメソッドは、円形のRNAに適用されています。現在、少なくとも12個のミニジーン・バックボーンが文献に記載されており、表1に要約されている。tRNAベースの発現系^21,22を除き^、それらはすべてポリメラーゼIIプロモーターに依存する。ここでは、円形RNAの生成に関与するシスおよびトランス作用因子を決定するヒトレポーターミニ遺伝子を生成する方法について述べる。公開されたレポーター遺伝子²³の配列を用いた方法の概要を図1に示す。