Coincubation assay voor het kwantificeren van concurrerende interacties tussen Vibrio fischeri isolaten
Summary
Bacteriën coderen diverse mechanismen voor het aangaan van interbacteriële concurrentie. Hier presenteren we een op cultuur gebaseerd protocol voor het karakteriseren van concurrerende interacties tussen bacteriële isolaten en hoe ze van invloed zijn op de ruimtelijke structuur van een gemengde populatie.
Abstract
Dit manuscript beschrijft een op cultuur gebaseerde, coincubation assay voor het opsporen en karakteriseren van concurrerende interacties tussen twee bacteriële populaties. Deze methode maakt gebruik van stabiele plasmiden die het mogelijk maken elke populatie te differentieel gelabeld met verschillende antibioticaresistentie capaciteiten en fluorescerende eiwitten voor selectie en visuele discriminatie van elke populatie, respectievelijk. Hier beschrijven we de voorbereiding en coincubatie van concurrerende Vibrio fischeri stammen, fluorescentiemicroscopie beeldvorming en kwantitatieve gegevensanalyse. Deze aanpak is eenvoudig, levert snelle resultaten op en kan worden gebruikt om te bepalen of een populatie de groei van een andere populatie doodt of remt, en of de concurrentie wordt gemedieerd door een diffugeerbaar molecuul of directe celcelcontact vereist. Omdat elke bacterie populatie een ander fluorescerend eiwit uitdrukt, maakt de bepaling de ruimtelijke discriminatie van concurrerende populaties in een gemengde kolonie mogelijk. Hoewel de beschreven methoden worden uitgevoerd met de symbiotische bacterie V. fischeri met voorwaarden die zijn geoptimaliseerd voor deze soort, kan het protocol worden aangepast voor de meeste culturable bacteriële isolaten.
Introduction
Dit manuscript schetst een op cultuur gebaseerde methode om te bepalen of twee bacteriële isolaten in staat zijn om concurrerende interacties te maken. Bij het bestuderen van gemengde populaties is het belangrijk om te beoordelen in hoeverre de bacteriële isolaten interageren, met name of isolaten rechtstreeks concurreren door middel van interferentie mechanismen. Interferentie concurrentie verwijst naar interacties waarbij één populatie direct de groei remt of een concurrent populatie doodt1. Deze interacties zijn belangrijk om te identificeren, omdat ze ingrijpende gevolgen kunnen hebben voor de structuur van een microbiële Gemeenschap en de functie2,3.
Mechanismen voor microbiële concurrentie zijn in grote lijnen ontdekt in het genoom van bacteriën uit diverse omgevingen, waaronder zowel gastheer-geassocieerde als vrijlevende bacteriën4,5,6,7, 8,9. Een verscheidenheid aan concurrentie strategieën zijn beschreven10,11 met inbegrip van diffundeerbaar mechanismen, zoals bactericide chemicaliën1,12 en uitgescheiden antimicrobiële peptiden13 , evenals contact afhankelijke mechanismen die celcelcontact vereisen om een remmende Effector over te brengen naar de doelcellen9,14,15,16,17 ,18.
Hoewel op cultuur gebaseerde coincubations vaak worden gebruikt in microbiologie5,8,19, schetst dit manuscript hoe de assay te gebruiken om het mechanisme van de concurrentie te karakteriseren, evenals suggesties voor het aanpassen van het protocol voor gebruik met andere bacteriesoorten. Bovendien beschrijft deze methode meerdere benaderingen voor het analyseren en presenteren van de gegevens om verschillende vragen over de aard van de concurrerende interacties te beantwoorden. Hoewel de hier beschreven technieken eerder werden gebruikt om het interbacteriële dodende mechanisme te identificeren dat onderliggende intraspecifieke concurrentie tussen symbiotische stammen van cogeïsoleerde Vibrio fischeri bacteriën19, zijn ze geschikt voor veel bacteriesoorten, waaronder milieu isolaten en menselijke pathogenen, en kunnen worden gebruikt om zowel contact afhankelijke als diffundeerbaar concurrerende mechanismen te evalueren. De stappen in het protocol kunnen optimalisatie vereisen voor andere bacteriesoorten. Gezien het feit dat meer modelsystemen hun studies verder uitbreiden dan het gebruik van isogene organismen om verschillende genotypen10,16,20,21te omvatten, zal deze methode een waardevolle bron zijn voor onderzoekers die willen begrijpen hoe de concurrentie invloed heeft op multi-strain of multi-species systemen.
Protocol
Representative Results
Discussion
De coincubation assay die hierboven is beschreven, biedt een krachtige methode om interbacteriële concurrentie te ontdekken. Deze aanpak stond in voor de identificatie van intraspecifieke concurrentie tussen V. fischeri isolaten en de karakterisering van het competitieve mechanisme19. Hoewel de beschreven methode geoptimaliseerd is voor de mariene bacterie V. fischeri, kan deze gemakkelijk worden aangepast om andere bacteriesoorten te herbergen, waaronder klinische en milieu-iso…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We willen reviewers bedanken voor hun nuttige feedback. A.N.S. werd gesteund door de Gordon en Betty Moore Foundation via Grant GBMF 255,03 aan de Life Sciences Research Foundation.
Materials
| 1.5 mL Microcentrifuge Tubes | Fisher | 05-408-129 | |
| 10 μL multichannel pipette | |||
| 100 μL multichannel pipette | |||
| 300 μL multichannel pipette | |||
| 10 μL single channel pipette | |||
| 20 μL single channel pipette | |||
| 200 μL single channel pipette | |||
| 1000 μL single channel pipette | |||
| 24-well plates | Fisher | 07-200-84 | sterile with lid |
| 96-well plates | VWR | 10062-900 | sterile with lid |
| Calculator | |||
| Chloramphenicol | Sigma | C0378 | stock (20 mg/mL in Ethanol); final concentration in media (2 μg /mL LBS) |
| Fluorescence dissecting microscope with camera and imaging software | |||
| forceps | Fisher | 08-880 | |
| Kanamycin Sulfate | Fisher | BP906-5 | stock (100 mg/mL in water, filter sterilize); final concentration in media (1 μg/mL LBS) |
| Nitrocellulose membrane (FS MCE, 25MM, NS) | Fisher | SA1J788H5 | 0.22 μm nitrocellulose membrane (pk of 100) |
| petri plates | Fisher | FB0875713 | sterile with lid |
| Spectrophotometer | |||
| Semi-micro cuvettes | VWR | 97000-586 | |
| TipOne 0.1-10 μL starter system | USA Scientific | 1111-3500 | 10 racks |
| TipOne 200 μL starter system | USA Scientific | 1111-500 | 10 racks |
| TipOne 1000 μL starter system | USA Scientific | 1111-2520 | 10 racks |
| Vortex | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LBS media | |||
| 1M Tris Buffer (pH ~7.5) | 50 mL 1 M stock buffer (62 mL HCl, 938 mL DI water, 121 g Trizma Base) | ||
| Agar Technical | Fisher | DF0812-17-9 | 15 g (Add only for plates) |
| DI water | 950 mL | ||
| Sodium Chloride | Fisher | S640-3 | 20 g |
| Tryptone | Fisher | BP97265 | 10 g |
| Yeast Extract | Fisher | BP9727-2 | 5 g |
References
- Hibbing, M. E., Fuqua, C., Parsek, M. R., Peterson, S. B. Bacterial competition: surviving and thriving in the microbial jungle. Nature Reviews Microbiology. 8 (1), 15-25 (2010).
- Nyholm, S. V., McFall-Ngai, M. The winnowing: establishing the squid-Vibrio symbiosis. Nature Reviews Microbiology. 2 (8), 632-642 (2004).
- Dörr, N. C. D., Blockesh, M. Bacterial type VI secretion system facilitates niche domination. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (36), 8855-8857 (2018).
- Maclntyre, D. L., Miyata, S. T., Kitaoka, M., Pukatzki, S. The Vibrio cholerae type VI secretion system displays antimicrobial properties. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (45), 19520-19524 (2010).
- Salomon, D., Gonzalez, H., Updegraff, B. L., Orth, K. Vibrio parahaemolyticus type VI secretion system 1 is activated in marine conditions to target bacteria, and is differentially regulated from system 2. PloS One. 8 (4), e61086 (2013).
- Sana, T. G., et al. Salmonella Typhimurium utilizes a T6SS-mediated antibacterial weapon to establish in the host gut. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (34), E5044-E5051 (2016).
- Schwarz, S., et al. Burkholderia type VI secretion systems have distinct roles in eukaryotic and bacterial cell interactions. PLoS Pathogens. 6 (8), e1001068 (2010).
- Wenren, L. M., Sullivan, N. L., Cardarelli, L., Septer, A. N., Gibbs, K. A. Two independent pathways for self-recognition in Proteus mirabilis are linked by type VI-dependent export. MBio. 4 (4), (2013).
- García-Bayona, L., Guo, M. S., Laub, M. T. J. E. Contact-dependent killing by Caulobacter crescentus via cell surface-associated, glycine zipper proteins. Elife. 6, 24869 (2017).
- Stubbendieck, R. M., Straight, P. D. Multifaceted interfaces of bacterial competition. Journal of bacteriology. 198 (16), 2145-2155 (2016).
- Cornforth, D. M., Foster, K. R. Antibiotics and the art of bacterial war. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (35), 10827-10828 (2015).
- Shank, E. A., Kolter, R. New developments in microbial interspecies signaling. Current Opinion in Microbiology. 12 (2), 205-214 (2009).
- Roelofs, K. G., Coyne, M. J., Gentyala, R. R., Chatzidaki-Livanis, M., Comstock, L. E. Bacteroidales secreted antimicrobial proteins target surface molecules necessary for gut colonization and mediate competition in vivo. MBio. 7 (4), e01055-e01016 (2016).
- Dey, A., Vassallo, C. N., Conklin, A. C., Pathak, D. T., Troselj, V., Wall, D. Sibling rivalry in Myxococcus xanthus is mediated by kin recognition and a polyploid prophage. Journal of bacteriology. 198 (6), (2016).
- Danka, E. S., Garcia, E. C., Cotter, P. A. Are CDI systems multicolored, facultative, helping greenbeards?. Trends in Microbiology. 25 (5), 391-401 (2017).
- Willett, J. L., Ruhe, Z. C., Coulding, C. W., Low, D. A., Hayes, C. S. Contact-dependent growth inhibition (CDI) and CdiB/CdiA two-partner secretion proteins. Journal of molecular biology. 427 (23), 3754-3765 (2015).
- Cianfanelli, F. R., Monlezun, L., Coulthurst, S. J. Aim, load, fire: the type VI secretion system, a bacterial nanoweapon. Trends in Microbiology. 24 (1), 51-62 (2016).
- Joshi, A., Kostiuk, B., Rogers, A., Teschler, J., Pukatzki, S., Yildiz, F. H. Rules of engagement: the type VI secretion system in Vibrio cholerae. Trends in microbiology. 25 (4), 267-279 (2017).
- Speare, L., et al. Bacterial symbionts use a type VI secretion system to eliminate competitors in their natural host. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (36), E8528-E8537 (2018).
- Shank, E. A. Using coculture to detect chemically mediated interspecies interactions. Journal of Visualized Experiments. (80), (2013).
- Long, R. A., Rowley, D. C., Zamora, E., Liu, J., Bartlett, D. H., Azam, F. Antagonistic interactions among marine bacteria impede the proliferation of Vibrio cholerae. Applied and Environmental Microbiology. 71 (12), 8531-8536 (2005).
- Dunn, A. K., Millikan, D. S., Adin, D. M., Bose, J. L., Stabb, E. V. New rfp-and pES213-derived tools for analyzing symbiotic Vibrio fischeri reveal patterns of infection and lux expression in situ. Applied and Environmental Microbiology. 72 (1), 802-810 (2006).
- Sana, T. G., et al. The second type VI secretion system of Pseudomonas aeruginosa strain PAO1 is regulated by quorum sensing and Fur and modulates internalization in epithelial cells. Journal of Biological Chemistry. 287 (32), 27095-27105 (2012).
- Bachmann, V., Kostiuk, B., Unterweger, D., Diaz-Satizabal, L., Ogg, S., Pukatzki, S. Bile salts modulate the mucin-activated type VI secretion system of pandemic Vibrio cholerae. PLoS. 9 (8), e0004031 (2015).
- Ishikawa, T., Rompikuntal, P. K., Lindmark, B., Milton, D. L., Wai, S. N. Quorum sensing regulation of the two hcp alleles in Vibrio cholerae O1 strains. PloS One. 4 (8), e6734 (2009).
- Ishikawa, T., et al. Pathoadaptive conditional regulation of the type VI secretion system in Vibrio cholerae O1 strains. Infection and immunity. 80 (2), 575-584 (2012).
- Pollack-Berti, A., Wollenberg, M. S., Ruby, E. G. Natural transformation of Vibrio fischeri requires tfoX and tfoY. Environmental Microbiology. 12 (8), 2302-2311 (2010).
- Meibom, K. L., Blockesh, M., Dolganov, N. A., Wu, C. Y., Schoolnik, G. K. Chitin induces natural competence in Vibrio cholerae. Science. 310 (5755), 1824-1827 (2005).
- Borgeaud, S., Metzger, L. C., Scrignari, T., Blockesh, M. The type VI secretion system of Vibrio cholerae fosters horizontal gene transfer. Science. 347 (6217), 63-67 (2015).
- Townsley, L., Mangus, M. P. S., Mehic, S., Yildiz, F. H. Response of Vibrio cholerae to low-temperature shift: CpsV regulates type VI secretion, biofilm formation, and association with zooplankton. Applied and Environmental Microbiology. 82 (14), 00807-00816 (2016).
- Huang, Y., et al. Functional characterization and conditional regulation of the type VI secretion system in Vibrio fluvialis. Frontiers in microbiology. 8, 528 (2017).
