In vivo Forward genética Screen para identificar novos genes neuroprotetores em Drosophila melanogaster

Os neurônios são para a maior parte pós-mitótico e incapaz de dividir^1,2. Na maioria dos animais, existem mecanismos neuroprotetores para manter essas células ao longo da vida útil do organismo, especialmente na velhice, quando os neurônios são mais vulneráveis a danos. Genes subjacentes a esses mecanismos podem ser identificados em mutantes exibindo neurodegeneração, um indicador fenotípico para a perda de neuroproteção, usando um protocolo genético para a frente. As telas genéticas da frente usando mutagénicos químicos tais como o Methanesulfonate do Ethyl (EMS) ou N-Ethyl-N-nitrosourea (ENU) são particular úteis devido às mutações de ponto aleatórias que induzem, tendo por resultado uma aproximação inerentemente imparcial que derramou a luz sobre funções numerosas do gene em organismos modelo eucarióticas^3,4,5 (no contraste, o mutagênese do raio X cria rupturas do ADN e pode conduzir ao rearranjo um pouco do que mutações do ponto⁶).

A mosca de fruto comum Drosophila melanogaster é um assunto ideal para estas telas devido à sua alta qualidade, seqüência de genoma bem anotado, sua longa história como um organismo modelo com ferramentas genéticas altamente desenvolvidas, e mais significativamente, sua compartilhada história evolucionária com seres humanos^7,8. Um fator limitante na aplicabilidade deste protocolo é a letalidade precoce causada pelos genes mutados, o que evitaria o teste na velhice⁹. No entanto, para mutações não letais, um ensaio de escalada, que aproveita os geotaxis negativos, é um método simples, embora extenso, de quantificar o funcionamento do motor prejudicada¹⁰. Para expor a suficiente reatividade locomotora, as moscas dependem das funções neurais para determinar a direção, sentir sua posição e coordenar o movimento. A incapacidade de moscas para escalar suficientemente em resposta a estímulos pode, portanto, indicar defeitos neurológicos¹¹. Uma vez que um phenotype de escalada defeituoso particular é identificado, uns testes mais adicionais usando uma tela secundária tal como a análise histológica do tecido de cérebro, podem ser usados para identificar a neurodegeneração em moscas de escalada-defeituosas. O traço subseqüente do gene pode então ser usado para revelar a região genomic no cromossoma que carreg o gene neuroprotetor defeituoso do interesse. Para restringir a região cromossômica de interesse, o mapeamento meiótico usando linhas de mosca mutante que transportam genes de marcadores dominantes com locais conhecidos no cromossomo pode ser realizado. Os genes do marcador servem como um ponto de referência para a mutação como a freqüência do recombinação entre dois loci fornece uma distância mensurável que possa ser usada para mapear a posição aproximada de um gene. Finalmente, cruzar as linhas do mutante com as linhas que carregam deficiências equilibradas na região cromossomática meioticamente mapeada de interesse cria um teste da complementação em que o gene do interesse pode ser verificado se seu phenotype conhecido é expressado⁵. Sequências de nucleotídeo polimorfónicos no gene identificado, possivelmente resultando em sequências de aminoácidos alteradas, podem ser avaliadas por sequenciamento do gene e comparando-a com a seqüência do genoma da Drosophila . A caracterização subseqüente do gene do interesse pode incluir o teste de alelos adicionais do mutante, de experiências do salvamento da mutação e da examinação de phenotypes adicionais.