Summary

소독멜라노가스터에서 새로운 신경보호 유전자를 식별하기 위한 생체 전방 유전자 스크린

Published: July 11, 2019
doi:

Summary

우리는 Drosophila melanogaster에있는 신경 변성을 전시하는 돌연변이를 위한 스크린에 전방 유전 접근을 사용하여 프로토콜을 제시합니다. 그것은 궁극적으로 신경 보호의 프로세스와 관련있는 새로운 유전자를 확인하기 위하여 등반 분석, 기관학 분석, 유전자 매핑 및 DNA 순서를 통합합니다.

Abstract

신경 퇴행성 질환의 발병과 진행에 대해 이해해야 할 것이 많이 있습니다. 화학 돌연변이원을 이용한 전방 유전자 스크리닝은 인간과 보존된 세포 경로를 공유하는 Drosophila 및 그밖 모형 유기체 중 유전자에 돌연변이 표현형을 매핑하기 위한 유용한 전략입니다. 관심의 돌연변이 유전자가 파리의 초기 발달 단계에서 치명적이지 않은 경우, 등반 분석은 낮은 등반 속도와 같은 감소 뇌 기능의 현상형 지표를 위해 스크리닝을 실시 할 수있다. 이어서, 뇌 조직의 이차 조직학적 분석은 신경변성 표현형을 채점함으로써 유전자의 신경보호 기능을 검증하기 위해 수행될 수 있다. 유전자 매핑 전략은 이러한 동일한 분석에 의존하는 meiotic 및 결핍 매핑을 포함하며, 관심 있는 유전자에서 가능한 뉴클레오티드 변화를 식별하기 위해 DNA 염기서열 분석이 뒤따를 수 있다.

Introduction

뉴런은 대부분 유사분열 후이며1,2를나눌 수 없습니다. 대부분의 동물에서, 신경 보호 메커니즘 유기 체의 수명 내내 이러한 세포를 유지 하기 위해 존재, 특히 노년 기에 뉴런은 손상에 가장 취약. 이러한 메커니즘의 근간이 되는 유전자는 전방 유전 프로토콜을 사용하여 신경 변성을 나타내는 돌연변이체에서 확인할 수 있습니다. 에틸 메탄설포네이트(EMS) 또는 N-에틸-N-니드로소레아(ENU)와 같은 화학적 돌연변이원을 이용한 전방 유전적 스크린은 유도하는 무작위 점 돌연변이로 인해 특히 유용하며, 이로 인해 본질적으로 편견없는 접근법이 빛을 발하고 있습니다. 진핵 모델 유기체3,4,5의 수많은 유전자 기능 (대조적으로, X선 돌연변이발생은 DNA 나누기를 생성하고 포인트 돌연변이가 아닌 재배열을 초래할 수 있다 6).

일반적인 과일 파리 Drosophila melanogaster는 그것의 높은 품질, 잘 달린 게놈 순서, 고도로 발달된 유전 공구를 가진 모형 유기체로 그것의 긴 역사 때문에 이 스크린을 위한 이상적인 주제이고, 가장 중요한 것은, 그것의 공유 인간과 진화역사7,8. 이 프로토콜의 적용가능성에 있는 제한 요인은 9세에 시험을 방지할 돌연변이된 유전자에 기인한초기 치사입니다. 그러나, 비 치명적인 돌연변이의 경우, 부정적인 지질 학적 을 활용하는 등반 분석법은 10 기능하는 손상된 모터를정량화하는 광범위한 방법이지만 간단합니다. 충분한 운동 반응성을 나타내기 위해 파리는 방향을 결정하고 위치를 감지하며 움직임을 조정하기 위해 신경 기능에 의존합니다. 파리가 자극에 반응하여 충분히 올라갈 수 없다는 것은 따라서 신경학적 결함11을나타낼 수 있다. 특정 결함이 있는 등반 표현형이 확인되면, 뇌 조직의 조직학적 분석과 같은 보조 스크린을 이용한 추가 테스트는 등반 결함이 있는 파리의 신경 변성을 식별하는 데 사용될 수 있습니다. 후속 유전자 매핑은 관심 있는 결함있는 신경 보호 유전자를 운반하는 염색체상에 게놈 영역을 밝히기 위하여 그 때 이용될 수 있습니다. 관심 있는 염색체 영역을 좁히기 위해, 염색체상에 공지된 위치를 가진 지배적인 마커 유전자를 운반하는 돌연변이 플라이 라인을 이용한 meiotic 매핑이 수행될 수 있다. 마커 유전자는 2개의 좌위 사이 재결합의 주파수가 유전자의 대략적인 위치를 지도로 하기 위하여 이용될 수 있는 측정 가능한 거리를 제공하기 때문에 돌연변이를 위한 기준점역할을 한다. 마지막으로, 관심 있는 중증 염색체 영역에 균형 잡힌 결핍을 운반하는 선으로 돌연변이 선을 교차하는 것은 그것의 알려진 표현형이 표현되는 경우에 관심있는유전자가 확인될 수 있는 보완 시험을 만듭니다 5. 확인된 유전자에서 다형성 뉴클레오티드 서열은, 아마도 변경된 아미노산 서열의 결과로, 유전자를 시퀀싱하고 이를 Drosophila 게놈 서열과 비교하여 평가될 수 있다. 관심 있는 유전자의 후속 특성화는 추가 돌연변이 대문자의 검사, 돌연변이 구조 실험 및 추가 표현형의 검사를 포함할 수 있다.

Protocol

1. 파리의 준비와 노화 유전 스크린을 위해 사용될 초파리 돌연변이체의 6체를 얻거나 생성한다. 여기서, 제2 염색체에 매핑되고 CyO를 통해 균형잡힌 ENU 돌연변이 선이 사용된다. 옥수수 밀밀 배지에 25 °C, 12 시간 빛 / 어두운 주기로 설정 인큐베이터에서 실험 유전자 형 라인을 증폭. 각 실험 유전자형에서 성인 외화의 0-2 일 사이에 약 20 동형 ?…

Representative Results

이러한 간질에서, 우리는 성인 파리에서 신경 무결성(예를 들어, 신경보호)의 유지에 역할을 하는 유전자 뇌종양(brat)을 식별하는 데 사용되는 단계를 제시한다(17; 신경 보호에 관여하는 유전자를 식별하는 데 사용할 수있는 방법론. 우리는 등반 분석법을 사용하여 화학적으로 돌연변이 된 파리의 컬렉션을 통해 스크리밍하는 전방 유전 접?…

Discussion

Drosophila에 있는 전방 유전 스크린은 나이 의존적인 신경 보호를 포함하여 다른생물학 프로세스에서 관련시킨 유전자를 확인하는 효과적인 접근이었습니다 5,23,24, 25. 이 전략을 사용하여, 우리는 새로운 신경 보호 유전자17로 brat를 확인하는 데 성공했습니다.

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Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

우리는 특히 배리 가네츠키 박사에게 감사드리며, 실험실에서 유전 스크린이 수행되어 신경 보호 유전자로서 brat의 식별 및 특성을 허용합니다. 우리는 친절이 문서에 제시된 유전 스크린에 사용된 ENU 돌연변이 파리의 컬렉션을 제공하는 스티븐 로비도우 박사에게 감사드립니다. 우리는 이 프로젝트의 기간 동안 도움이 토론에 대한 Ganetzky 연구소의 구성원, 박사 그레이스 보호프 – 포크와 데이비드 Wassarman, 링 링 호와 밥 크레버 기술 지원에 대한, 박사 아키 이케다에서 자신의 마이크로 토메 시설의 사용에 대한 감사 위스콘신 대학교와 킴 래키 박사, 앨라배마 대학교 광학 분석 시설.

Materials

Major equipment
Fume hood for histology
Light Microscope Nikon Eclipe E100 Preferred objective for imaging is X20
Imaging software Nikon
Microscope Camera Nikon
Thermal cycler Eppendorf
Fly pushing and climbing assay
VWR® Drosophila Vial, Narrow VWR 75813-160
VWR® General-Purpose Laboratory Labeling Tape VWR 89097-912
Standard mouse pad
Stereoscope Motic Model SMZ-168
CO2 anesthesia station (Blowgun, foot valve, Ultimate Flypad) Genesee Scientific 54-104, 59-121, 59-172 Doesn’t iinclude CO2 tank
Fine-Tip Brushes SOLO HORTON BRUSHES, INC.
Drosophila Incubator VWR 89510-750
Gene mapping
CantonS Bloomington Drosophila Stock Center 9517
w1118 Bloomington Drosophila Stock Center 5905
yw  Bloomington Drosophila Stock Center 6599
Drosophila line used for recombination mapping Bloomington Drosophila Stock Center 3227 Genotype: wg[Sp-1] J[1] L[2] Pin[1]/CyO, P{ry[+t7.2]=ftz/lacB}E3
CyO/sno[Sco]  Bloomington Drosophila Stock Center 2555 Drosophila balancer line used for recombination mapping
Deficiency Kit for chromosome 2L Bloomington Drosophila Stock Center DK2L Cook et al., 2012
Histology analysis
Ethanol, (100%) Thermo Fischer Scientific A4094
Chloroform Thermo Fischer Scientific C298-500
Glacial Acetic Acid Thermo Fischer Scientific A38-500
Fisherbrand™ Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5mL Thermo Fischer Scientific 05-408-129
Histochoice clearing agent 1X VWR Life Sciences 97060-934
Harris Hematoxylin VWR 95057-858
Eosin VWR 95057-848
Thermo Scientific™ Richard-Allan Scientific™ Mounting Medium Thermo Scientific™ 4112 22-110-610 CyO/sna[Sco]
Unifrost Poly-L-Lysine microscope slides, 75x25x1mm, EverMark Select Plus Azer Scientific
Fisherbrand™ Cover Glasses: Rectangles Fisherbrand 12-545M Dimensions: 24×60 mm
Traceable timer VWR
Slide Warmer Barnstead International model no. 26025
Slide tray and racks DWK Life Sciences Rack to hold 20 slides
Fisherbrand™ General-Purpose Extra-Long Forceps Fisherbrand 10-316A
Kimwipes™ Kimberly-Clark™ Professional 
6 inch Puritan applicators Hardwood Products Company, Guilford, Maine 807-12
VWR® Razor Blades VWR 55411-050
Tupperware or glass containers for histology liquids 16 + 1 for running water
High Profile Coated Microtome Blades VWR 95057-834
Corning™ Round Ice Bucket with Lid, 4L Corning™
Beaker Or other container for ice water and cassettes
Tissue Bath Precision Scientific Company 66630
Microtome Leica Biosystems
Molecular analysis
Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System Promega A9282
Ex Taq DNA polymerase TaKaRa 5 U/μl
Invitrogen™ SYBR™ Safe™ DNA Gel Stain   Invitrogen™
UltraPure™ Agarose  Invitrogen™
1 Kb Plus DNA Ladder  Invitrogen™
ApE-A plasmid Editor software Available for free download
Statistical analysis
R software package
Further analysis
y[1] w[*]; wg[Sp-1]/CyO; Dr[1]/TM3, Sb[1] Bloomington Drosophila Stock Center 59967

References

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Citer Cet Article
Gevedon, O., Bolus, H., Lye, S. H., Schmitz, K., Fuentes-González, J., Hatchell, K., Bley, L., Pienaar, J., Loewen, C., Chtarbanova, S. In Vivo Forward Genetic Screen to Identify Novel Neuroprotective Genes in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (149), e59720, doi:10.3791/59720 (2019).

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