Separation av Råtta Epidermis och Dermis med Thermolysin för att upptäcka platsspecifik inflammatorisk mRNA och protein
Summary
Presenteras här är ett protokoll för separation av epidermis från dermis för att utvärdera inflammatorisk medlarproduktion. Efter inflammation separeras råtta bakpott epidermis från dermis med termolysin vid 4 °C. Epidermis används sedan för mRNA analys av RT-PCR och protein utvärdering av västra fläck och immunohistokemi.
Abstract
Lättanvända och billiga tekniker behövs för att bestämma den platsspecifika produktionen av inflammatoriska medlare och neurotroner under hudskada, inflammation och / eller sensibilisering. Målet med denna studie är att beskriva ett epidermal-dermal separation protokoll med termolysin, ett proteinas som är aktivt vid 4 °C. För att illustrera detta förfarande bedövas Sprague Dawley råttor, och höger bak tassar injiceras med carrageenan. Sex och tolv timmar efter injektion avlivas råttor med inflammation och naiva råttor, och en bit bakpott, glabrous hud placeras i kalla Dulbecco’s Modified Eagle Medium. Epidermis separeras sedan vid källarmembranet från dermis med termolysin i PBS med kalciumklorid. Därefter säkras dermis av mikrodissektionstång, och epidermis retas försiktigt bort. Toluidinblå färgning av vävnad avsnitt visar att epidermis separeras rent från dermis vid källarmembranet. Alla keratinocyte cell lager förblir intakt, och epidermal rete åsar tillsammans med indragningar från dermal papillae observeras tydligt. Kvalitativ och realtid RT-PCR används för att bestämma nervtillväxtfaktor och interleukin-6 uttryck nivåer. Western blotting och immunohistochemistry utförs slutligen för att upptäcka mängder av nerv tillväxtfaktor. Denna rapport illustrerar att kall termolysin matsmältning är en effektiv metod för att skilja epidermis från dermis för utvärdering av mRNA och protein förändringar under inflammation.
Introduction
Utvärdering av inflammatoriska medlare och neurotrofa faktorer från huden kan begränsas på grund av heterogeniteten hos celltyper som finns i den inflammerade dermis och epidermis1,2,3. Flera enzymer, kemiska, termiska eller mekaniska tekniker som innebär separation av de två skikten eller för att utföra celldisociation för utvärdering har granskats nyligen4. Syra, alkali, neutralt salt och värme kan dela epidermis från dermis snabbt, men cellulär och extracellulär svullnad förekommerofta 5,6. Trypsin, bukspottkörtel, elastas, keratinas, kollagenas, pronas, dispas och termolysin är enzymer som har använts för epidermal-dermal separation4,7. Trypsin och andra bred skala proteolytiska enzymer är aktiva vid 37-40 °C men måste övervakas noggrant för att förhindra dissociation av epidermala lager. Dispase klyver epidermis vid lamina densa, men kräver 24 h för separation ikylan 4,8 eller kortare tidspunkter vid 37 °C4,9. En begränsande egenskap hos alla dessa tekniker är den potentiella störningen av vävnad morfologi och förlust av integritet av mRNA och protein.
För att upprätthålla mRNA:s och proteinets integritet bör en hudseparationsmetod utföras i kylan under en kort tidsperiod. Vid utvärdering av hudseparationsteknik för inflammationsstudier är termolysin ett effektivt enzym för att separera epidermis från dermis vid kalla temperaturer4. Thermolysin är aktiv vid 4 °C, klyver epidermala hemidesmosomes från lamina lucida och separerar epidermis från dermis inom 1-3 h4,8,10. Målet med denna rapport är att optimera användningen av termolysin för separation av inflammerad råtta epidermis från dermis för att upptäcka mRNA och proteinnivåer för inflammatoriska medlare och neurotrofa faktorer. Flera preliminära rapporter har presenterats11,12,13,14,15. Syftet med detta manuskript är att beskriva en optimal hudseparationsteknik med termolysin och visa detektion av 1) markörer för inflammation, 2) interleukin-6 (IL-6) mRNA och 3) nervtillväxtfaktor (NGF) mRNA och protein i epidermis av råttor med carrageenan-inducerad inflammation (C-II)16,17. En preliminär rapport med den kompletta Freunds adjuvansmodell indikerar att NGF mRNA och proteinnivåer ökar tidigt under inflammation15. Hos möss orsakar hudsensibilisering med den aktuella tillämpningen av oxazolon en tidig ökning av IL-6 mRNA med hjälp av in situ hybridisering36. Både IL-6 och NGF har varit inblandade i C-II18,19, men det har inte förekommit några rapporter som beskriver mRNA eller proteinnivåer för IL-6 eller NGF specifikt från epidermis under de akuta stadierna av C-II.
Termolysintekniken är billig och enkel att utföra. Dessutom tillåter termolysinseparation av epidermis från dermis mRNA, western blot och immunohistochemical analys av inflammatoriska medlare och neurotrofa faktorer underinflammationsprocessen 15. Prövare bör enkelt kunna använda denna teknik i både prekliniska och kliniska studier av hudinflammation.
Protocol
Representative Results
Discussion
Studien visade att epidermis av råtta bakpott glabrous hud lätt separerades från läderhud med termolysin (0,5 mG/mL) i PBS med 1 mM kalciumklorid vid 4 °C för 2,5 h. Histologiska utvärdering anges att epidermis separerades från läderhuden vid källarmembranet och att epidermal rete åsar var intakt. Thermolysin är en extracellulär metalloendopeptidas producerad av Grampositiv(Geo)Bacillus thermoproteolyticus24. Dess aktivitet är stabil vid 4 °C men fungerar över ett…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Finansiering för denna forskning tillhandahölls av National Institutes of Health NIH-AR047410 (KEM)
Materials
| λ-carrageenan | Millipore Sigma | 22049 | Subcutaneous injection of carrageenan induces inflammation |
| 7500 Fast Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | 4351107 | For RT-PCR analysis |
| Calcium chloride (CaCl2), anhydrous | Millipore Sigma | 499609 | Prevents autolysis of thermolysin |
| Crystal Mount Aqueous Mounting Medium | Millipore Sigma | C0612 | Aqueous mounting medium after toluidine blue staining |
| Donkey anti-Mouse Alexa Fluor 555 | Thermo Fisher Scientific | A-31570 | Secondary antibody for immunohistochemistry |
| Donkey anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-21206 | Secondary antibody for immunohistochemistry |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Thermo Fisher Scientific | 11966-025 | To maintain tissue integrity |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Millipore Sigma | E6758 | Stops thermolysin reaction |
| Moloney Murine Leukemia Virus (M-MLV) Reverse transcriptase | Promega | M1701 | For complementary DNA synthesis |
| Mouse anti-NGF Antibody (E-12) | Santa Cruz Biotechnology | sc-365944 | For neurotrophin immunohistochemistry |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36930 | To retard immunofluorescence quenching |
| Rabbit anti-PGP 9.5 | Cedarlane Labs | CL7756AP | For intraepidermal nerve staining |
| SAS Sprague Dawley Rat | Charles River | Strain Code 400 | Animal used for inflammation studies |
| Shandon M-1 Embedding Matrix | Thermo Fisher Scientific | 1310TS | Tissue embedding matrix for tinctorial- and immuno-histochemistry |
| SimpliAmp Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | A24811 | For RT-PCR analysis |
| SYBR Select Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4472908 | For RT-PCR analysis |
| Thermolysin | Millipore Sigma | T7902 | From Geobacillus stearothermophilus |
| Toluidine Blue | Millipore Sigma | 89640 | For tinctorial staining for brightfield microscopy |
| TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | For total RNA extraction for RTPCR |
References
- Choi, J. E., Di Nardo, A. Skin neurogenic inflammation. Seminars in Immunopathology. 40 (3), 249-259 (2018).
- Manti, S., Brown, P., Perez, M. K., Piedimonte, G. The role of neurotrophins in inflammation and allergy. Vitamins and Hormones. 104, 313-341 (2017).
- Schäkel, K., Schön, M. P., Ghoreschi, K. Pathogenesis of psoriasis. Zeitschrift für Dermatologie, Venerologie, und verwandte Gebiete. 67 (6), 422-431 (2016).
- Zou, Y., Maibach, H. I. Dermal-epidermal separation methods: research implications. Archives of Dermatological Research. 310 (1), 1-9 (2018).
- Baumberger, J. Methods for the separation of epidermis from dermis and some physiologic and chemical properties of isolated epidermis. Journal of the National Cancer Institute. 2, 413-423 (1942).
- Felsher, Z. Studies on the adherence of the epidermis to the corium. Journal of Investigative Dermatology. 8, 35-47 (1947).
- Einbinder, J. M., Walzer, R. A., Mandl, I. Epidermal-dermal separation with proteolytic enzymes. Journal of Investigative Dermatology. 46, 492-504 (1966).
- Rakhorst, H. A., et al. Mucosal keratinocyte isolation: a short comparative study on thermolysin and dispase. International Association of Oral and Maxillofacial Surgeons. 35 (10), 935-940 (2006).
- Tschachler, E., et al. Sheet preparations expose the dermal nerve plexus of human skin and render the dermal nerve end organ accessible to extensive analysis. Journal of Investigative Dermatology. 122 (1), 177-182 (2004).
- Walzer, C., Benathan, M., Frenk, E. Thermolysin treatment-a new method for dermo-epidermal separation. Journal of Investigative Dermatology. 92, 78-81 (1989).
- Anderson, M. B., Miller, K. E., Schechter, R. Evaluation of rat epidermis and dermis following thermolysin separation: PGP 9.5 and Nav 1.8 localization. Society for Neuroscience Abstract. 584 (9), (2010).
- Ibitokun, B. O., Anderson, M. B., Miller, K. E. Separation of corneal epithelium from the stroma using thermolysin: evaluation of corneal afferents. Society for Neuroscience Abstract. , 584 (2010).
- Nawani, P., Anderson, M., Miller, K. E. Structure-property relationship of skin. Oklahoma Center for Neuroscience Symposium Abstract. , (2011).
- Anderson, M. B., Miller, K. E. Intra-epidermal nerve fiber reconstruction and quantification in three-dimensions. Society for Neuroscience Abstract. 220, 23 (2017).
- Gujar, V. K. E., Miller, K. E. Expression of nerve growth factor in adjuvant-induced arthritis (AIA): A temporal study. Society for Neuroscience Abstract. 220, 23 (2017).
- Vinegar, R., et al. to carrageenan-induced inflammation in the hind limb of the rat. Federation Proceedings. 46 (1), 118-126 (1987).
- Fehrenbacher, J. C., Vasko, M. R., Duarte, D. B. Models of inflammation: Carrageenan- or complete Freund’s Adjuvant (CFA)-induced edema and hypersensitivity in the rat. Current Protocols in Pharmacology. , (2012).
- Li, K. K., et al. exerts its anti-inflammatory effects associated with suppressing ERK/p38 MAPK and Heme Oxygenase-1 activation in lipopolysaccharide-stimulated RAW 264.7 macrophages and carrageenan-induced mice paw edema. International Immunopharmacology. 54, 366-374 (2018).
- Sammons, M. J., et al. Carrageenan-induced thermal hyperalgesia in the mouse: role of nerve growth factor and the mitogen-activated protein kinase pathway. Brain Research. 876 (1-2), 48-54 (2000).
- Hoffman, E. M., Miller, K. E. Peripheral inhibition of glutaminase reduces carrageenan induced Fos expression in the superficial dorsal horn of the rat. Neuroscience Letters. 472 (3), 157-160 (2010).
- Crosby, H. A., Ihnat, M., Spencer, D., Miller, K. E. Expression of glutaminase and vesicular glutamate transporter type 2 immunoreactivity in rat sacral dorsal root ganglia following a surgical tail incision. Pharmacy and Pharmacology International Journal. 2 (3), 00023 (2015).
- Hoffman, E. M., Schechter, R., Miller, K. E. Fixative composition alters distributions of immunoreactivity for glutaminase and two markers of nociceptive neurons Nav1.8 and TRPV1, in the rat dorsal ganglion. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 58 (4), 329-344 (2010).
- Hoffman, E. M., Zhang, Z., Schechter, R., Miller, K. E. Glutaminase increases in rat dorsal root ganglion neurons after unilateral adjuvant-induced hind paw inflammation. Biomolecules. 6 (1), 10 (2016).
- van den Burg, B., Eijsink, V. Thermolysin and related Bacillus metallopeptidases. Handbook of Proteolytic Enzymes. , 540-553 (2013).
- Matthews, B. W. Thermolysin. Encyclopedia of Inorganic and Bioinorganic Chemistry. , (2011).
- Hybbinette, S., Boström, M., Lindberg, K. Enzymatic dissociation of keratinocytes from human skin biopsies for in vitro cell propagation. Experimental Dermatology. 8 (1), 30-38 (1999).
- Glade, C. P., et al. Multiparameter flow cytometric characterization of epidermal cell suspensions prepared from normal and hyperproliferative human skin using an optimized thermolysin-trypsin protocol. Archives of Dermatological Research. 288 (4), 203-210 (1996).
- Sato, J. D., Kan, M. Media for culture of mammalian cells. Current Protocols in Cell Biology. , (2001).
- Gragnani, A., Sobral, C. S., Ferreira, L. M. Thermolysin in human cultured keratinocyte isolation. Brazilian Journal of Biology. 67 (1), 105-109 (2007).
- Germain, L., et al. Improvement of human keratinocyte isolation and culture using thermolysin. Burns. 19 (2), 99-104 (1993).
- Michel, M., et al. Characterization of a new tissue-engineered human skin equivalent with hair. In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 35 (6), 318-326 (1999).
- Fassina, G., et al. Autolysis of thermolysin. Isolation and characterization of a folded three-fragment complex. European Journal of Biochemistry. 156 (2), 221-228 (1986).
- Petho, G., Reeh, P. W. Sensory and signaling mechanisms of bradykinin, eicosanoids, platelet-activating factor, and nitric oxide in peripheral nociceptors. Physiological Reviews. 92 (4), 1699-1775 (2012).
- Djouhri, L., et al. Time course and nerve growth factor dependence of inflammation-induced alterations in electrophysiological membrane properties in nociceptive primary afferent neurons. Journal of Neuroscience. 21 (22), 8722-8733 (2001).
- Denk, F., Bennett, D. L., McMahon, S. B. Nerve growth factor and pain mechanisms. Annual Review of Neuroscience. 40, 307-325 (2017).
- Flint, M. S., Dearman, R. J., Kimber, I., Hotchkiss, S. A. Production and in situ localization of cutaneous tumour necrosis factor alpha (TNF-alpha) and interleukin 6 (IL-6) following skin sensitization. Cytokine. 10 (3), 213-219 (1998).
- Crosby, H. A., Ihnat, M., Miller, K. E. Evaluating the toxicity of the analgesic glutaminase inhibitor 6-diazo-5-oxo-L-norleucine in vitro and on rat dermal skin fibroblasts. MOJ Toxicology. 1 (1), 00005 (2015).
