Separação de Epiderme de Rato e Derme com Termolise para Detectar mRNA inflamatório específico do local e proteína
Summary
Apresentado aqui é um protocolo para a separação da epiderme da derme para avaliar a produção de mediadores inflamatórios. Após a inflamação, a epiderme da pata traseira de rato é separada da derme por termolysina a 4 °C. A epiderme é então usada para análise de mRNA por RT-PCR e avaliação de proteínas por mancha ocidental e imunohistoquímica.
Abstract
Técnicas fáceis de usar e baratas são necessárias para determinar a produção específica do local de mediadores inflamatórios e neurotrophins durante lesões, inflamações e/ou sensibilização da pele. O objetivo deste estudo é descrever um protocolo de separação epidérmico-dérmica usando termolysina, uma proteína que está ativa a 4 °C. Para ilustrar este procedimento, os ratos Sprague Dawley são anestesiados, e as patas traseiras direitas são injetadas com carrageenan. Seis e doze horas após a injeção, ratos com inflamação e ratos ingênuos são eutanizados, e um pedaço de pata traseira, pele glabrous é colocada no frio Dulbecco’s Modified Eagle Medium. A epiderme é então separada na membrana do porão da derme por termolysina em PBS com cloreto de cálcio. Em seguida, a derme é protegida por fórceps de microdisseção, e a epiderme é gentilmente provocada. A coloração azul toluidina das seções teciduais mostra que a epiderme é separada limpamente da derme na membrana do porão. Todas as camadas celulares queratinócitos permanecem intactas, e as cristas epidérmicas de rete, juntamente com recuos de papilas dérmicas são claramente observadas. O RT-PCR qualitativo e em tempo real é usado para determinar o fator de crescimento nervoso e os níveis de expressão interleucina-6. Manchas ocidentais e imunohistoquímica são finalmente realizadas para detectar quantidades de fator de crescimento nervoso. Este relatório ilustra que a digestão da termolise fria é um método eficaz para separar a epiderme da derme para avaliação de alterações de mRNA e proteínas durante a inflamação.
Introduction
A avaliação de mediadores inflamatórios e fatores neurotróficos da pele pode ser limitada devido à heterogeneidade dos tipos celulares encontrados na derme inflamada e epiderme1,2,3. Várias enzimas, técnicas químicas, térmicas ou mecânicas envolvendo separação das duas camadas ou para a realização da dissociação celular para avaliação foram revisadas recentemente4. Ácido, álcali, sal neutro e calor podem dividir a epiderme da derme rapidamente, mas o inchaço celular e extracelular geralmente ocorre5,6. Tripo, pancreatina, descamefástase, keratinase, colagenase, pronase, dispase e termolise são enzimas que foram usadas para separação epidérmico-dérmica4,7. Trippsina e outras enzimas proteolíticas de larga escala estão ativas a 37-40 °C, mas devem ser monitoradas cuidadosamente para evitar a dissociação de camadas epidérmicas. Dispase corta a epiderme na lamina densa, mas requer 24h para separação no frio4,8 ou pontos de tempo mais curtos a 37 °C4,9. Uma característica limitante de todas essas técnicas é a potencial interrupção da morfologia tecidual e perda de integridade de mRNA e proteína.
Para manter a integridade do mRNA e da proteína, um método de separação da pele deve ser realizado no frio por um curto período de tempo. Na avaliação das técnicas de separação da pele para estudos de inflamação, a termolise é uma enzima eficaz para separar a epiderme da derme a temperaturas frias4. A termolise está ativa a 4 °C, corta hemidesmosmosomos epidérmicos da lamina lucida, e separa a epiderme da derme dentro de 1-3 h4,8,10. O objetivo deste relatório é otimizar o uso de termolysina para separação de epiderme inflamada de ratos inflamados da derme para detectar níveis de mRNA e proteína para mediadores inflamatórios e fatores neurotróficos. Vários relatórios preliminares foram apresentados11,12,13,14,15. O objetivo deste manuscrito é descrever uma técnica ideal de separação da pele utilizando termolysina e demonstrar a detecção de 1) marcadores de inflamação, 2) interleucina-6 (IL-6) mRNA, e 3) mRNA e proteína na epiderme de ratos com inflamação induzida por carrageenano (C-II)16,17. Um relatório preliminar usando o modelo adjuvante completo da Freund indica que os níveis de MRNA e proteína ngf aumentam precocemente durante a inflamação15. Em camundongos, a sensibilização da pele com a aplicação tópica da oxazolona causa um aumento precoce no IL-6 mRNA usando a hibridização in situ36. Tanto o IL-6 quanto o NGF foram implicados em C-II18,19, mas não houve relatos que descrevam níveis de mRNA ou proteína para IL-6 ou NGF especificamente da epiderme durante os estágios agudos de C-II.
A técnica de termolise é barata e simples de executar. Além disso, a separação termolísina da epiderme da derme permite a análise mRNA, western blot e imunohistoquímica de mediadores inflamatórios e fatores neurotróficos durante o processo de inflamação15. Os pesquisadores devem ser capazes de usar facilmente essa técnica em estudos pré-clínicos e clínicos de inflamação cutânea.
Protocol
Representative Results
Discussion
O estudo determinou que a epiderme da pele de pata traseira de rato foi facilmente separada da derme usando termolise (0,5 mG/mL) em PBS com cloreto de cálcio de 1 mM a 4 °C por 2,5 h. A avaliação histológica indicou que a epiderme foi separada da derme na membrana do porão e que as cristas de rete epidérmicas estavam intactas. Termolysina é um metalloendopeptidase extracelular produzido por Gram-positivo (Geo)Bacillus thermoproteolyticus24. Sua atividade é estável a 4 …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
O financiamento para esta pesquisa foi fornecido pelos Institutos Nacionais de Saúde NIH-AR047410 (KEM)
Materials
| λ-carrageenan | Millipore Sigma | 22049 | Subcutaneous injection of carrageenan induces inflammation |
| 7500 Fast Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | 4351107 | For RT-PCR analysis |
| Calcium chloride (CaCl2), anhydrous | Millipore Sigma | 499609 | Prevents autolysis of thermolysin |
| Crystal Mount Aqueous Mounting Medium | Millipore Sigma | C0612 | Aqueous mounting medium after toluidine blue staining |
| Donkey anti-Mouse Alexa Fluor 555 | Thermo Fisher Scientific | A-31570 | Secondary antibody for immunohistochemistry |
| Donkey anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-21206 | Secondary antibody for immunohistochemistry |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Thermo Fisher Scientific | 11966-025 | To maintain tissue integrity |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Millipore Sigma | E6758 | Stops thermolysin reaction |
| Moloney Murine Leukemia Virus (M-MLV) Reverse transcriptase | Promega | M1701 | For complementary DNA synthesis |
| Mouse anti-NGF Antibody (E-12) | Santa Cruz Biotechnology | sc-365944 | For neurotrophin immunohistochemistry |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36930 | To retard immunofluorescence quenching |
| Rabbit anti-PGP 9.5 | Cedarlane Labs | CL7756AP | For intraepidermal nerve staining |
| SAS Sprague Dawley Rat | Charles River | Strain Code 400 | Animal used for inflammation studies |
| Shandon M-1 Embedding Matrix | Thermo Fisher Scientific | 1310TS | Tissue embedding matrix for tinctorial- and immuno-histochemistry |
| SimpliAmp Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | A24811 | For RT-PCR analysis |
| SYBR Select Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4472908 | For RT-PCR analysis |
| Thermolysin | Millipore Sigma | T7902 | From Geobacillus stearothermophilus |
| Toluidine Blue | Millipore Sigma | 89640 | For tinctorial staining for brightfield microscopy |
| TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | For total RNA extraction for RTPCR |
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