부위별 염증성 mRNA 및 단백질을 검출하기 위해 열립신과 쥐 표피 및 진피의 분리
Summary
여기에 제시된 표피의 분리를 위한 프로토콜이 진피로부터 염증성 중재자 생산을 평가하기 위한 것이다. 염증에 따라, 쥐 뒷발 표피는 4°C에서 열리신에 의해 진피로부터 분리된다. 표피는 그 때 서쪽 blot 및 면역 작용화학에 의하여 RT-PCR 및 단백질 평가에 의하여 mRNA 분석을 위해 이용됩니다.
Abstract
사용이 간편하고 저렴한 기술은 피부 손상, 염증 및/또는 민감화 중에 염증 성 중재자 및 신경 영양증의 사이트 별 생산을 결정하는 데 필요합니다. 이 연구의 목적은 4°C에서 활성단백질인 써모리신을 사용하여 표피-진피 분리 프로토콜을 설명하는 것이다. 이 절차를 설명하기 위해, 스프라그 Dawley 쥐는 마취되고, 오른쪽 뒷발은 카라지난으로 주입됩니다. 주입 후 6 시간 및 12 시간, 염증과 순진한 쥐를 가진 쥐는 안락사되고, 뒷발, 글라브루스 피부는 차가운 덜벡코의 수정 된 독수리 매체에 배치됩니다. 표피는 염화칼슘을 가진 PBS에 있는 열분해에 의해 진피에서 지하 막에서 분리됩니다. 다음으로, 진피는 미세 절 집게에 의해 고정되고 표피가 부드럽게 조롱됩니다. 조직 섹션의 Toluidine 파란색 염색은 표피가 지하 막의 진피에서 깨끗하게 분리되어 있음을 보여줍니다. 모든 각질 세포 층은 그대로 유지되며, 진피 유두의 들여쓰기와 함께 표피 리트 능선이 명확하게 관찰됩니다. 질적 및 실시간 RT-PCR은 신경 성장 인자와 인터류키-6 발현 수준을 결정하는 데 사용됩니다. 서양 블로팅 및 면역 히토화학은 마침내 신경 성장 인자의 양을 검출하기 위해 수행됩니다. 이 보고는 감기 열분해 소화가 염증 도중 mRNA및 단백질 변경의 평가를 위한 진피에서 표피를 분리하는 효과적인 방법이다는 것을 보여줍니다.
Introduction
염증성 진피 및 표피1,2,3에서발견되는 세포 유형의 이질성으로 인해 피부로부터의 염증성 중식 및 신경영양인의 평가가 제한될 수 있다. 평가를 위해 세포 해리를 수행하기 위해 2층의 분리 또는 수행을 위한 여러 효소, 화학적, 열 또는 기계적 기술이 최근4개검토되고 있다. 산, 알칼리, 중성염 및 열은 표피를 진피로부터 빠르게 나눌 수 있지만 세포 및 세포 외 부종은 종종5,6에서발생합니다. 트립신, 췌장, 엘라스타제, 각질, 콜라게나아제, 프라나제, 디스파제 및 열량리신은 표피-진피 분리4,7에사용된 효소이다. 트립신 및 기타 광범위한 스케일 의 성기 분석 효소는 37-40 °C에서 활성화되지만 표피 층의 해리를 방지하기 위해 주의 깊게 모니터링해야합니다. 디스파스는 라미나 덴사에서 표피를 갈라놓지만, 감기4,8 또는 37°C4,9에서더 짧은 시간점에서 분리를 위해 24h가 필요하다. 이러한 모든 기술의 제한 적인 특징은 조직 형태학의 잠재적인 중단 및 mRNA와 단백질의 무결성의 손실.
mRNA와 단백질의 무결성을 유지하기 위해, 피부 분리 방법은 짧은 시간 동안 추위에서 수행되어야한다. 염증 연구를 위한 피부 분리 기술을 평가할 때, 써모리신은 추운 온도4에서진피로부터 표피를 분리하는 효과적인 효소이다. 열리신은 4°C에서 활성화되며, 라미나 루치다로부터 표피 이미데스모좀을 갈라지고, 표피를 1-3h4,8,10내의 진피로부터 분리한다. 이 보고서의 목표는 염증성 중재자 및 신경 영양 요인에 대한 mRNA 및 단백질 수준을 검출하기 위해 진피에서 염증이 있는 쥐 표피의 분리를 위한 열립혈증의 사용을 최적화하는 것입니다. 여러 예비 보고서는11,12,13,14,15를제시했다. 이 원고의 목적은 열분해신을 이용한 최적의 피부 분리 기법을 설명하고 염증의 1) 마커, 2) 인터류킨-6(IL-6) mRNA, 및 3) 신경 성장 인자(NGF) mRNA 및 단백질을 카라게난 유발 염증(C-II)16,17의표피에서 시연하는 것이다. 완전한 Freund의 보조 모델을 사용하여 예비 보고서는 NGF mRNA및 단백질 수준이 염증15도중 일찌기 증가한다는 것을 나타냅니다. 마우스에서, oxazolone의 국소 적용을 이용한 피부 민감화는 시투혼성화(36)에서사용하는 IL-6 mRNA에서 조기 상승을 일으킨다. IL-6과 NGF 는 모두 C-II18,19에서연루되었지만 C-II의 급성 단계 동안 표피로부터 특히 IL-6 또는 NGF에 대한 mRNA 또는 단백질 수준을 설명하는 보고는 없었습니다.
열리 신 기술은 저렴 하 고 수행 하기 간단. 더욱이, 진피로부터 표피의 열리신 분리는염증(15)의과정에서 염증 중과및 신경영양인의 mRNA, 서부 블롯 및 면역히스트토화학적 분석을 허용한다. 연구원은 쉽게 피부 염증의 전임상 및 임상 연구 모두에서이 기술을 사용할 수 있어야 합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
연구 결과에 따르면, 2.5h에 4°C에서 염화칼슘 1m로 PBS에서 써모리신(0.5 mG/mL)을 사용하여 진피로부터 쥐 뒷발 글래브루스 피부의 표피를 쉽게 분리하였다고 판단했다. 조직학적 평가는 표피가 지하 막의 진피로부터 분리되었고 표피 레테 능선이 손상되지 않았다는 것을 나타냈다. 열량은 그람 양성(Geo)바실러스 열염기 용해성 분석기(24)에의해 생성된 세포 외 금속 loe…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구를 위한 자금조달은 건강 NIH-AR047410 (KEM)의 국가 학회에 의해 제공되었습니다
Materials
| λ-carrageenan | Millipore Sigma | 22049 | Subcutaneous injection of carrageenan induces inflammation |
| 7500 Fast Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | 4351107 | For RT-PCR analysis |
| Calcium chloride (CaCl2), anhydrous | Millipore Sigma | 499609 | Prevents autolysis of thermolysin |
| Crystal Mount Aqueous Mounting Medium | Millipore Sigma | C0612 | Aqueous mounting medium after toluidine blue staining |
| Donkey anti-Mouse Alexa Fluor 555 | Thermo Fisher Scientific | A-31570 | Secondary antibody for immunohistochemistry |
| Donkey anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-21206 | Secondary antibody for immunohistochemistry |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Thermo Fisher Scientific | 11966-025 | To maintain tissue integrity |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Millipore Sigma | E6758 | Stops thermolysin reaction |
| Moloney Murine Leukemia Virus (M-MLV) Reverse transcriptase | Promega | M1701 | For complementary DNA synthesis |
| Mouse anti-NGF Antibody (E-12) | Santa Cruz Biotechnology | sc-365944 | For neurotrophin immunohistochemistry |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36930 | To retard immunofluorescence quenching |
| Rabbit anti-PGP 9.5 | Cedarlane Labs | CL7756AP | For intraepidermal nerve staining |
| SAS Sprague Dawley Rat | Charles River | Strain Code 400 | Animal used for inflammation studies |
| Shandon M-1 Embedding Matrix | Thermo Fisher Scientific | 1310TS | Tissue embedding matrix for tinctorial- and immuno-histochemistry |
| SimpliAmp Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | A24811 | For RT-PCR analysis |
| SYBR Select Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4472908 | For RT-PCR analysis |
| Thermolysin | Millipore Sigma | T7902 | From Geobacillus stearothermophilus |
| Toluidine Blue | Millipore Sigma | 89640 | For tinctorial staining for brightfield microscopy |
| TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | For total RNA extraction for RTPCR |
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