Scheiding van rat epidermis en dermis met thermolysine om site-specifieke inflammatoire mRNA en eiwit te detecteren
Summary
Hier wordt een protocol gepresenteerd voor de scheiding van epidermis van dermis om de productie van ontstekingsmediators te evalueren. Na ontsteking wordt de epidermis van de achterpoot van de rat gescheiden door thermolysine bij 4 °C. De epidermis wordt vervolgens gebruikt voor mRNA-analyse door RT-PCR en eiwitevaluatie door westerse vlek en immunohistochistry.
Abstract
Eenvoudig te gebruiken en goedkope technieken zijn nodig om de site-specifieke productie van ontstekingsmediators en neurotrofinen tijdens huidletsel, ontsteking en / of sensibilisatie te bepalen. Het doel van deze studie is om een epidermale-dermale scheidingsprotocol te beschrijven met behulp van thermolysine, een proteïnase dat actief is bij 4 °C. Om deze procedure te illustreren, worden Sprague Dawley-ratten verdoofd en worden rechterachterpoten geïnjecteerd met carrageen. Zes en twaalf uur na injectie worden ratten met ontstekingen en naïeve ratten geëuthanaseerd en een stukje achterpoot, glabroushuid wordt in het gemodificeerde adelaarsmedium van koude Dulbecco geplaatst. De epidermis wordt vervolgens in het keldermembraan van de dermis gescheiden door thermolysine in PBS met calciumchloride. Vervolgens wordt de dermis vastgezet door microdissectie-tang en wordt de epidermis voorzichtig weg geplaagd. Toluidine blauwe kleuring van weefselsecties tonen aan dat de epidermis netjes wordt gescheiden van de dermis op het keldermembraan. Alle keratinocytcellagen blijven intact en de epidermale reteruggen samen met inkepingen van dermale papillen worden duidelijk waargenomen. Kwalitatieve en real-time RT-PCR wordt gebruikt om zenuwgroeifactor en interleukine-6 expressieniveaus te bepalen. Westerse blotting en immunohistochie worden eindelijk uitgevoerd om hoeveelheden zenuwgroeifactor te detecteren. Dit rapport illustreert dat koude thermolysinevertering een effectieve methode is om epidermis van dermis te scheiden voor evaluatie van mRNA en eiwitveranderingen tijdens ontsteking.
Introduction
Evaluatie van inflammatoire mediatoren en neurotrofe factoren van de huid kan worden beperkt als gevolg van de heterogeniteit van celtypen gevonden in de ontstoken dermis en epidermis1,2,3. Verschillende enzymen, chemische, thermische of mechanische technieken waarbij de twee lagen worden gescheiden of voor het uitvoeren van celdissociatie voor evaluatie zijn onlangs herzien4. Zuur, alkali, neutraal zout en warmte kunnen de epidermis van dermis snel verdelen, maar cellulaire en extracellulaire zwelling treedt vaak op5,6. Trypsine, pancreatin, elastase, keratinase, collagenase, pronase, dispase en thermolysine zijn enzymen die zijn gebruikt voor epidermale-dermale scheiding4,7. Trypsine en andere proteolytische enzymen op grote schaal zijn actief bij 37-40 °C, maar moeten zorgvuldig worden gecontroleerd om dissociatie van epidermale lagen te voorkomen. Dispase splijt de epidermis bij de lamina densa, maar vereist 24 uur voor scheiding in de koude4,8 of kortere tijdspunten bij 37 °C4,9. Een beperkend kenmerk van al deze technieken is de mogelijke verstoring van weefselmorfologie en verlies van integriteit van mRNA en eiwitten.
Om de integriteit van mRNA en eiwitten te behouden, moet een huidscheidingsmethode gedurende een korte periode in de kou worden uitgevoerd. Bij het evalueren van huidscheidingstechnieken voor ontstekingsstudies is thermolysine een effectief enzym om de opperhuid van dermis te scheiden bij koude temperaturen4. Thermolysine is actief bij 4 °C, splijt epidermale hemidesmosomen van de lamina lucida en scheidt de epidermis van dermis binnen 1–3 h4,8,10. Het doel van dit rapport is om het gebruik van thermolysine te optimaliseren voor de scheiding van ontstoken rattenepidermis van dermis om mRNA- en eiwitniveaus voor ontstekingsmediators en neurotrofe factoren te detecteren. Er zijn verschillende voorlopige verslagen gepresenteerd11,12,13,14,15. Het doel van dit manuscript is om een optimale huidscheidingstechniek met thermolysine te beschrijven en de detectie van 1) markers van ontsteking, 2) interleukine-6 (IL-6) mRNA, en 3) zenuwgroeifactor (NGF) mRNA en eiwit in de epidermis van ratten met carrageen-geïnduceerde ontsteking (C-II)16,17. Een voorlopig rapport met behulp van het volledige Freund’s adjuvansmodel geeft aan dat de NGF mRNA- en eiwitspiegels vroeg toenemen tijdens ontsteking15. Bij muizen veroorzaakt huidsensibilisatie met de topische toepassing van oxazolone een vroege stijging van het IL-6 mRNA met behulp van in situ hybridisatie36. Zowel IL-6 als NGF zijn betrokken bij C-II18,19, maar er zijn geen rapporten die mRNA- of eiwitniveaus voor IL-6 of NGF specifiek beschrijven vanuit de epidermis tijdens de acute stadia van C-II.
De thermolysinetechniek is goedkoop en eenvoudig uit te voeren. Bovendien maakt thermolysinescheiding van de epidermis van dermis mRNA, westelijke vlek en immunohistochemische analyse van ontstekingsmediators en neurotrofe factoren tijdens het ontstekingsprocesmogelijk 15. Onderzoekers moeten deze techniek gemakkelijk kunnen gebruiken in zowel preklinische als klinische studies naar huidontsteking.
Protocol
Representative Results
Discussion
De studie stelde vast dat de epidermis van de glabroushuid van de achterpoot van ratten gemakkelijk van dermis kon worden gescheiden met behulp van thermolysine (0,5 mG/ml) in PBS met 1 mM calciumchloride bij 4 °C gedurende 2,5 uur. Histologische evaluatie wees uit dat de epidermis gescheiden was van de dermis op het keldermembraan en dat de epidermale reteruggen intact waren. Thermolysine is een extracellulair metalloendopeptidase geproduceerd door Gram-positive (Geo)Bacillus thermoproteolyticus<sup c…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De financiering van dit onderzoek werd verstrekt door de National Institutes of Health NIH-AR047410 (KEM)
Materials
| λ-carrageenan | Millipore Sigma | 22049 | Subcutaneous injection of carrageenan induces inflammation |
| 7500 Fast Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | 4351107 | For RT-PCR analysis |
| Calcium chloride (CaCl2), anhydrous | Millipore Sigma | 499609 | Prevents autolysis of thermolysin |
| Crystal Mount Aqueous Mounting Medium | Millipore Sigma | C0612 | Aqueous mounting medium after toluidine blue staining |
| Donkey anti-Mouse Alexa Fluor 555 | Thermo Fisher Scientific | A-31570 | Secondary antibody for immunohistochemistry |
| Donkey anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-21206 | Secondary antibody for immunohistochemistry |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Thermo Fisher Scientific | 11966-025 | To maintain tissue integrity |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Millipore Sigma | E6758 | Stops thermolysin reaction |
| Moloney Murine Leukemia Virus (M-MLV) Reverse transcriptase | Promega | M1701 | For complementary DNA synthesis |
| Mouse anti-NGF Antibody (E-12) | Santa Cruz Biotechnology | sc-365944 | For neurotrophin immunohistochemistry |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36930 | To retard immunofluorescence quenching |
| Rabbit anti-PGP 9.5 | Cedarlane Labs | CL7756AP | For intraepidermal nerve staining |
| SAS Sprague Dawley Rat | Charles River | Strain Code 400 | Animal used for inflammation studies |
| Shandon M-1 Embedding Matrix | Thermo Fisher Scientific | 1310TS | Tissue embedding matrix for tinctorial- and immuno-histochemistry |
| SimpliAmp Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | A24811 | For RT-PCR analysis |
| SYBR Select Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4472908 | For RT-PCR analysis |
| Thermolysin | Millipore Sigma | T7902 | From Geobacillus stearothermophilus |
| Toluidine Blue | Millipore Sigma | 89640 | For tinctorial staining for brightfield microscopy |
| TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | For total RNA extraction for RTPCR |
References
- Choi, J. E., Di Nardo, A. Skin neurogenic inflammation. Seminars in Immunopathology. 40 (3), 249-259 (2018).
- Manti, S., Brown, P., Perez, M. K., Piedimonte, G. The role of neurotrophins in inflammation and allergy. Vitamins and Hormones. 104, 313-341 (2017).
- Schäkel, K., Schön, M. P., Ghoreschi, K. Pathogenesis of psoriasis. Zeitschrift für Dermatologie, Venerologie, und verwandte Gebiete. 67 (6), 422-431 (2016).
- Zou, Y., Maibach, H. I. Dermal-epidermal separation methods: research implications. Archives of Dermatological Research. 310 (1), 1-9 (2018).
- Baumberger, J. Methods for the separation of epidermis from dermis and some physiologic and chemical properties of isolated epidermis. Journal of the National Cancer Institute. 2, 413-423 (1942).
- Felsher, Z. Studies on the adherence of the epidermis to the corium. Journal of Investigative Dermatology. 8, 35-47 (1947).
- Einbinder, J. M., Walzer, R. A., Mandl, I. Epidermal-dermal separation with proteolytic enzymes. Journal of Investigative Dermatology. 46, 492-504 (1966).
- Rakhorst, H. A., et al. Mucosal keratinocyte isolation: a short comparative study on thermolysin and dispase. International Association of Oral and Maxillofacial Surgeons. 35 (10), 935-940 (2006).
- Tschachler, E., et al. Sheet preparations expose the dermal nerve plexus of human skin and render the dermal nerve end organ accessible to extensive analysis. Journal of Investigative Dermatology. 122 (1), 177-182 (2004).
- Walzer, C., Benathan, M., Frenk, E. Thermolysin treatment-a new method for dermo-epidermal separation. Journal of Investigative Dermatology. 92, 78-81 (1989).
- Anderson, M. B., Miller, K. E., Schechter, R. Evaluation of rat epidermis and dermis following thermolysin separation: PGP 9.5 and Nav 1.8 localization. Society for Neuroscience Abstract. 584 (9), (2010).
- Ibitokun, B. O., Anderson, M. B., Miller, K. E. Separation of corneal epithelium from the stroma using thermolysin: evaluation of corneal afferents. Society for Neuroscience Abstract. , 584 (2010).
- Nawani, P., Anderson, M., Miller, K. E. Structure-property relationship of skin. Oklahoma Center for Neuroscience Symposium Abstract. , (2011).
- Anderson, M. B., Miller, K. E. Intra-epidermal nerve fiber reconstruction and quantification in three-dimensions. Society for Neuroscience Abstract. 220, 23 (2017).
- Gujar, V. K. E., Miller, K. E. Expression of nerve growth factor in adjuvant-induced arthritis (AIA): A temporal study. Society for Neuroscience Abstract. 220, 23 (2017).
- Vinegar, R., et al. to carrageenan-induced inflammation in the hind limb of the rat. Federation Proceedings. 46 (1), 118-126 (1987).
- Fehrenbacher, J. C., Vasko, M. R., Duarte, D. B. Models of inflammation: Carrageenan- or complete Freund’s Adjuvant (CFA)-induced edema and hypersensitivity in the rat. Current Protocols in Pharmacology. , (2012).
- Li, K. K., et al. exerts its anti-inflammatory effects associated with suppressing ERK/p38 MAPK and Heme Oxygenase-1 activation in lipopolysaccharide-stimulated RAW 264.7 macrophages and carrageenan-induced mice paw edema. International Immunopharmacology. 54, 366-374 (2018).
- Sammons, M. J., et al. Carrageenan-induced thermal hyperalgesia in the mouse: role of nerve growth factor and the mitogen-activated protein kinase pathway. Brain Research. 876 (1-2), 48-54 (2000).
- Hoffman, E. M., Miller, K. E. Peripheral inhibition of glutaminase reduces carrageenan induced Fos expression in the superficial dorsal horn of the rat. Neuroscience Letters. 472 (3), 157-160 (2010).
- Crosby, H. A., Ihnat, M., Spencer, D., Miller, K. E. Expression of glutaminase and vesicular glutamate transporter type 2 immunoreactivity in rat sacral dorsal root ganglia following a surgical tail incision. Pharmacy and Pharmacology International Journal. 2 (3), 00023 (2015).
- Hoffman, E. M., Schechter, R., Miller, K. E. Fixative composition alters distributions of immunoreactivity for glutaminase and two markers of nociceptive neurons Nav1.8 and TRPV1, in the rat dorsal ganglion. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 58 (4), 329-344 (2010).
- Hoffman, E. M., Zhang, Z., Schechter, R., Miller, K. E. Glutaminase increases in rat dorsal root ganglion neurons after unilateral adjuvant-induced hind paw inflammation. Biomolecules. 6 (1), 10 (2016).
- van den Burg, B., Eijsink, V. Thermolysin and related Bacillus metallopeptidases. Handbook of Proteolytic Enzymes. , 540-553 (2013).
- Matthews, B. W. Thermolysin. Encyclopedia of Inorganic and Bioinorganic Chemistry. , (2011).
- Hybbinette, S., Boström, M., Lindberg, K. Enzymatic dissociation of keratinocytes from human skin biopsies for in vitro cell propagation. Experimental Dermatology. 8 (1), 30-38 (1999).
- Glade, C. P., et al. Multiparameter flow cytometric characterization of epidermal cell suspensions prepared from normal and hyperproliferative human skin using an optimized thermolysin-trypsin protocol. Archives of Dermatological Research. 288 (4), 203-210 (1996).
- Sato, J. D., Kan, M. Media for culture of mammalian cells. Current Protocols in Cell Biology. , (2001).
- Gragnani, A., Sobral, C. S., Ferreira, L. M. Thermolysin in human cultured keratinocyte isolation. Brazilian Journal of Biology. 67 (1), 105-109 (2007).
- Germain, L., et al. Improvement of human keratinocyte isolation and culture using thermolysin. Burns. 19 (2), 99-104 (1993).
- Michel, M., et al. Characterization of a new tissue-engineered human skin equivalent with hair. In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 35 (6), 318-326 (1999).
- Fassina, G., et al. Autolysis of thermolysin. Isolation and characterization of a folded three-fragment complex. European Journal of Biochemistry. 156 (2), 221-228 (1986).
- Petho, G., Reeh, P. W. Sensory and signaling mechanisms of bradykinin, eicosanoids, platelet-activating factor, and nitric oxide in peripheral nociceptors. Physiological Reviews. 92 (4), 1699-1775 (2012).
- Djouhri, L., et al. Time course and nerve growth factor dependence of inflammation-induced alterations in electrophysiological membrane properties in nociceptive primary afferent neurons. Journal of Neuroscience. 21 (22), 8722-8733 (2001).
- Denk, F., Bennett, D. L., McMahon, S. B. Nerve growth factor and pain mechanisms. Annual Review of Neuroscience. 40, 307-325 (2017).
- Flint, M. S., Dearman, R. J., Kimber, I., Hotchkiss, S. A. Production and in situ localization of cutaneous tumour necrosis factor alpha (TNF-alpha) and interleukin 6 (IL-6) following skin sensitization. Cytokine. 10 (3), 213-219 (1998).
- Crosby, H. A., Ihnat, M., Miller, K. E. Evaluating the toxicity of the analgesic glutaminase inhibitor 6-diazo-5-oxo-L-norleucine in vitro and on rat dermal skin fibroblasts. MOJ Toxicology. 1 (1), 00005 (2015).
