Uso de la Invertebrada Galleria mellonella como Modelo de Infección para Estudiar el Complejo Mycobacterium tuberculosis
Summary
Galleria mellonella se estableció recientemente como un modelo de infección reproducible, barato y éticamente aceptable para el complejo Mycobacterium tuberculosis. Aquí describimos y demostramos los pasos dados para establecer una infección exitosa de G. mellonella con Bioluminiscente Mycobacterium bovis BCG lux.
Abstract
La tuberculosis es la principal causa mundial de mortalidad por enfermedades infecciosas y se cree que aproximadamente una cuarta parte de la población mundial está infectada con Mycobacteriumtuberculosis. A pesar de décadas de investigación, muchos de los mecanismos detrás del éxito de M. tuberculosis como organismo patógeno aún están por investigar, y el desarrollo de medicamentos antimicobacterianos más seguros y eficaces son urgentemente necesarios para hacer frente al aumento y propagación de la tuberculosis farmacorresistente. Sin embargo, la progresión de la investigación de la tuberculosis se debe al cuello de botella de los modelos tradicionales de infección de mamíferos que son costosos, lentos y éticamente desafiantes. Anteriormente establecimos las larvas del insecto Galleria mellonella (mayor polilla de cera) como un modelo de infección novedoso, reproducible, de bajo costo, de alto rendimiento y éticamente aceptable para los miembros del complejo M. tuberculosis. Aquí describimos el mantenimiento, preparación e infección de G. mellonella con Bioluminiscentmycobacterium bovis BCG lux. Usando este modelo de infección, se puede observar virulencia dependiente de la dosis micobacteriana, y una lectura rápida de la carga micobacteriana in vivo utilizando mediciones de bioluminiscencia es fácilmente alcanzable y reproducible. Aunque existen limitaciones, como la falta de un genoma totalmente anotado para el análisis transcriptomático, se puede realizar análisis ontológicos contra insectos genéticamente similares. Como modelo de bajo costo, rápido y éticamente aceptable para la tuberculosis, G. mellonella se puede utilizar como pre-pantalla para determinar la eficacia y toxicidad de los medicamentos, y para determinar la virulencia micobacteriana comparativa antes del uso de mamíferos convencionales Modelos. El uso del modelo G. mellonella-mycobacterias conducirá a una reducción del número sustancial de animales utilizados actualmente en la investigación de la tuberculosis.
Introduction
La tuberculosis (TB) es una amenaza importante para la salud pública mundial, con 9 millones de nuevos casos al año y 1,5 millones de muertes1. Además, se estima que una cuarta parte de la población mundial está infectada con el agente causante de la enfermedad, Mycobacterium tuberculosis (Mtb). Entre la población infectada, entre el 5 y el 10 % desarrollará la enfermedad de tuberculosis activa a lo largo de su vida. Además, la aparición y propagación de Mtb resistente a múltiples fármacos (MDR) y ampliamente farmacológicos (XDR)representa una grave amenaza para el control de enfermedades, y 123 países informan al menos de un caso XDR 1. El tratamiento de la tuberculosis requiere un cóctel de al menos cuatro medicamentos antimicobacterianos, de los cuales se prescriben isoniazida y rifampicina por una duración mínima de seis meses; a menudo se asocia con efectos secundarios complejos y toxicidades. La protección contra la única vacuna autorizada contra la tuberculosis, Mycobacterium bovis Bacillus Calmette-Guérin (BCG), es la variable 2. Una comprensión incompleta de la patogénesis de la tuberculosis dificulta significativamente el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas y de vacunación.
Durante décadas, los modelos de infección animal han sido vitales para que la investigación de la tuberculosis comprenda la patogénesis básica y la respuesta del huésped a la infección, y para evaluar nuevos agentes antimicobacterianos, inmunoterapéuticos y nuevos candidatos a vacunas3, 4. Sin embargo, la investigación utilizando modelos de infección animal de tuberculosis es notoriamente difícil ya que la patogénesis y la progresión de la infección por tuberculosis son complejas, y no hay un solo modelo animal que imite todo el espectro y las características importantes de la enfermedad5 ,6. Además, los experimentos con animales son costosos, consumen mucho tiempo para llevar a cabo y requieren una justificación ética completa. No obstante, se han descrito modelos de infección animal de tuberculosis en primates no humanos (por ejemplo, macacos), conejillos de indias, conejos, bovinos, cerdos, ratones y peces cebra, y cada uno tiene sus limitaciones3,4. El modelo murino es el modelo más utilizado debido al costo, disponibilidad de líneas endogámicas, reproducibilidad de la infección y abundancia de reactivos inmunológicos. Sin embargo, por lo general no forman granulomas asociados con áreas de hipoxia que son características de la infección por tuberculosis latente (LTBI)6. Los cerdos de Guinea son altamente susceptibles a la infección por Mtb, con patología y formación temprana de granuloma similares a los de los seres humanos, y se utilizan ampliamente en las pruebas de vacunas; sin embargo, la falta de reactivos inmunológicos dificulta su uso como infección modelo7. Los peces cebra son adecuados para el cribado a gran escala en estudios preclínicos en etapas tempranas debido a su pequeño tamaño, reproducción rápida y herramientas genéticas avanzadas, pero son anatómica y fisiológicamente diferentes a los seres humanos y sólo son susceptibles a Infección por Mycobacterium marinum 3. Los modelos animales que se asemejan más a la infección humana por Mtb son primates no humanos (por ejemplo, el macaco), pero son caros y tienen consideraciones éticas y prácticas significativas que limitan considerablemente su uso8.
La larva de insectos de la polilla de cera mayor o polilla de panal,Galleria mellonella, se han vuelto cada vez más populares como modelo de infección para una variedad de patógenos bacterianos y fúngicos9,y como una pantalla para nuevos candidatos a fármacos antimicrobianos 10. G. mellonella es un modelo invertebrado exitoso debido a su sofisticado sistema inmunológico innato (compuesto por defensas celulares y humorales) que comparte un alto grado de similitud estructural y funcional con el de los vertebrados11 . Esto incluye mecanismos inmunes como la fagocitosis de patógenos por hemocitos (funcionalmente similar a los macrófagos y neutrófilos de mamíferos)12,13, la producción y circulación de péptidos antimicrobianos (AMP) y proteínas similares a complementos dentro de la hemolinfa (análogos a la sangre de mamíferos) de G. mellonella11. Otras ventajas9,14,15 de G. mellonella larvas como modelo incluyen 1) su gran tamaño (20-30 mm) que permite una fácil manipulación e infección, así como la recolección de tejido y hemolinfa para análisis, 2) fácil mantenimiento a 37 oC, compatible para el estudio de patógenos humanos, 3) infección precisa por inyección sin necesidad de anestesia, 4) la eficacia de los agentes antimicrobianos puede evaluarse utilizando menos fármacos para evaluación, 5) falta de las limitaciones éticas en comparación con el uso de mamíferos, 6) tamaños de grupo grande se pueden utilizar en comparación con los modelos animales que permiten una mayor reproducibilidad, y 7) tiempos más cortos para experimentos de infección se requieren.
En un estudio reciente, demostramos que G. mellonella puede ser utilizado como un modelo de infección novedoso para estudiar la patogénesis de la infección por Bioluminiscente M. bovis BCG lux, una versión modificada genéticamente de la cepa vacunal y miembro del complejo Mtb (MTBC)16. Mientras que G. mellonella se ha utilizado previamente como un modelo de infección para micobacterias no tuberculosas (NTM), principalmente M. marinum y Mycobacterium absceso17,18, los estudios con MTBC se limitan a 16. Las cepas micobacterianas bioluminiscentes no patógenas, que se pueden utilizar a nivel de contención (CL) 2 como sustituto de Mtb, ofrecen las ventajas de seguridad y practicidad sobre las micobacterias patógenas. Después de la infección por BCG lux, las larvas comienzan a desarrollar estructuras tempranas similares al granuloma, lo que podría proporcionar información valiosa sobre el papel de la inmunidad innata en el establecimiento de la infección por tuberculosis16. Además, este sencillo modelo de infección por invertebrados tiene el potencial de proporcionar una evaluación rápida, de bajo costo y confiable de la patogénesis de la tuberculosis que incorpora desafío controlado y múltiples réplicas de reproducibilidad. Además, el modelo tiene el potencial de ser utilizado para examinar nuevos candidatos a fármacos antituberculosos y vacunas en desarrollo temprano, reduciendo el número total de animales en experimentación. La capacidad de medir los cambios en la estructura del huésped y del patógeno, el transcriptoma y el proteoma para determinar las dianas farmacológicas y evaluar los mecanismos de acción de nuevos fármacos y vacunas terapéuticas también son ventajosas.
Aquí describimos los protocolos experimentales para la preparación de un bioluminiscente M. bovis BCG lux inoculum y larvas de G. mellonella para la infección micobacteriana, así como la determinación de larvas y micobacterias supervivencia en respuesta a la infección.
Protocol
Representative Results
Discussion
Se ha establecido el uso de G. mellonella como modelo de infección para una serie de patógenos bacterianos y fúngicos para el estudio de la virulencia, la interacción huésped-patógeno, y como una pantalla para las nuevas terapias10,22. La siguiente discusión se basa en el procedimiento experimental para el uso de G. mellonella como modelo de infección para el MTBC.
La salud de las larvas ingenuas ante…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este proyecto fue apoyado por subvenciones del Consejo de Investigación en Biotecnología y Ciencias Biológicas (BBSRC), otorgados a PRL e YL (BB/P001262/1), y el Centro Nacional para la Sustitución, Refinamiento y Reducción de Animales en Investigación (NC3Rs) otorgados a PRL, SMN, BDR e YL (NC/R001596/1).
Materials
| 1.5ml reaction tube (Eppendorf) | Eppendorf | 22431021 | |
| 20, 200 and 1000 µl pipette and filtered tips | Any supplier | n/a | |
| 24 well culture plate | Greiner | 662160 | |
| 25 ml pipettes and pipette boy | Any supplier | n/a | |
| 3 compartment Petri dish (94/15mm) | Greiner | 637102 | |
| Centrifuge | Any supplier | n/a | |
| Class II saftey cabinet | Any supplier | n/a | |
| Erlenmeyer flask with vented cap (250 ml) | Corning | CLS40183 | |
| Ethanol (>99.7%) | VWR | 208221.321 | |
| Galleria mellonella (250 per pk) | Livefood Direct UK | W250 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5150 | |
| Homogeniser (FastPrep-24 5G ) | MP Biomedicals | 116005500 | |
| Hygromycin B | Corning | 30-240CR | |
| Luminometer (Autolumat LB 953) | Berthold | 34622 | |
| Luminometer tubes | Corning | 352054 | |
| Lysing matrix (S, 2.0ml) | MP Biomedicals | 116925500 | |
| Micro syringe (25 µl, 25 ga) | SGE | 3000 | |
| Microcentrifuge | Any supplier | n/a | |
| Middlebrook 7H11 agar | BD Bioscience | 283810 | |
| Middlebrook 7H9 broth | BD Bioscience | 271310 | |
| Middlebrook ADC enrichment | BD Bioscience | 212352 | |
| Middlebrook OADC enrichment | BD Bioscience | 212240 | |
| Mycobacterium bovis BCG lux | Various | n/a | |
| n-decyl aldehyde | Sigma-Aldrich | D7384-100G | |
| Orbital shaking incubator | Any supplier | n/a | |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P4417-100TAB | |
| Polysorbate 80 (Tween-80) | Sigma-Aldrich | P8074-500ml | |
| Small box | Any supplier | n/a | dark vented or non-sealed box recommended |
| Tweezer | Any supplier | n/a | Short and narrow tipped/Blunt long tweezers |
| Winterm (V1.08) | Berthold | n/a | Program LB953.TTB |
| Petri dish (94/15mm) | Greiner | 633181 | |
| Filter paper (94mm) | Any supplier | n/a | Cut to fit |
References
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