RRNA 2'-O-메틸화의 DNAzyme 의존분석

1. 균주, 미디어 및 버퍼 레시피 여기에 자세히 설명된 효모(S. cerevisiae)미디어를 준비하십시오 : YP (효모 추출물 1 % / v, 2 % w / v 세균 펩톤), 포도당 및 갈락토제 주식 20 % w / v. 여기에 자세히 설명된 바와 같이 아세테이트 나트륨(NaAc)-EDTA(AE) 완충재를 준비합니다: 50 mM NaAc pH 5.3 및 10 mM EDTA. 여기에 자세히 설명된 대로 10-23 DNAzyme 4x 배양 버퍼를 준비하십시오: 24 mM Tris pH 8.0, 60 mM NaCl 및 10-23 DNAzyme 4x 반응 버퍼: 200 mM Tris pH 8.0 및 600 mM NaCl. 여기에 자세히 설명 된 대로 8-17 DNAzyme 2x 반응 버퍼를 준비하십시오 : 200 mM KCl, 800 mM NaCl, 100 mM HEPES pH 7.0, 15 mM MgCl2,및 15 mM MnCl2. 여기에 자세히 설명 된 대로 10x MOPS 버퍼를 준비하십시오 : 200 mM MOPS, 50 mM NaAc, 1 mM EDTA; pH 7.0 및 1.5x 샘플 변성 버퍼: 50% v/v 포르마미드, 20% v/v 포름알데히드, 1.5x MOPS 버퍼. 취득 S. 세레비시아균주, BY4741(MATa his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0); GAL1::SNR13 (BY4741로 하지만 GAL1::SNR13:KANmX); GAL1::SNR47 (BY4741로 하지만 GAL1::SNR47:HIS3mX). 다른 효모 변형은 이 해석에 사용할 수 있습니다. 2. DNAzyme 디자인 적절한 데이터베이스를 사용하여 관심 있는 RNA 서열 또는 메틸화 부위를 찾습니다. S. 세레비시아 스노RNA 표적의 경우 효모 스노RNA 데이터베이스를 사용하십시오: http://people.biochem.umass.edu/fournierlab/snornadb/mastertable.php14 관심 있는 메틸화 부위를 찾으려면, 예를 들어, snR13 의존 부위, “snR13″을 선택하고 변형된 뉴클레오티드의 위치를 기록한다(예를 들어, snR13-유도 A2281 에서 25S rRNA). 적절한 데이터베이스를 사용하여 변형된 뉴클레오티드의 상류 및 하류 서열을 찾습니다. S. 세레비시아에 대 한, 사카로 마이세스 게놈 데이터베이스를 사용 하 여: https://www.yeastgenome.org/ 표적 유전자 이름 예를 들어, RDN25(코딩 25S rRNA)를 검색한다. “서열” 탭에서, 8-17 DNAzyme에 대한 메틸화 부위의 10-23 DNAzyme 분석 및 20 개의 뉴클레오티드 상류(5′ 암) 및 다운스트림(3’arm)을 사용할 때 메틸화 부위의 상류(5′ 암) 및 하류(3’arm)를 선택한다. 5′ 및 3′ 팔의 상호 보완적인 시퀀스를 만듭니다. 측면 10-23 또는 8-17 DNAzyme 촉매 시퀀스 5′ 및 3′ 팔의 상보적 서열. 공급 업체로부터 정상적인 DNA 올리고 뉴클레오티드로 DNAzyme을 주문하십시오. 3. S. 세레비시아 성장 조건 참고: S. 세레비시아 BY4741 스트레인 유도체가 사용되었고, 이 때 SNR13 또는 SNR47 스노RNA의 발현은 유도성 GAL1 프로모터로부터 구동된다. 그들의 합성을 유도또는 억제하기 위해, 갈락토오스(GAL1-의존성 전사) 또는 포도당(GAL1-의존적 전사 떨어져 있는)을 함유하는 배지상에서 세포를 성장시다. 대조군으로, 갈락토오스 또는 포도당에서 자란 야생형 균주(BY4741)를 사용한다. 적절한 배지 및 조건에서 효모 균주를 성장시다. GAL1::SNR13 및 GAL1:SNR47 균주뿐만 아니라 이원성 야생형 균주들을 분석하려면, 30°C에서 중간 지수상에 2% 포도당(YPD) 또는 갈락토제(YPGal)를 가진 YP 매체의 50 mL에서 세포를 성장시다. 1,000 x g에서원심 분리세포, 4°C에서 3분. 상급을 버리고 펠릿을 유지하십시오. 액체 질소에 세포 펠릿을 동결하고 -80 °C에서 저장합니다.주의 사항: 액체 질소는 심한 극저온 화상을 일으킬 수 있습니다. 항상 보호복을 착용하고 안전 예방 조치를 취해야 합니다.참고: 세포 펠릿은 -80°C에서 최대 1개월까지 보관할 수 있다. 필요한 경우 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다. 4. RNA 격리15 참고: RNA를 분리하는 가장 적절한 방법을 사용하십시오. 효모 S. 세레비시아에대해 핫 페놀 RNA 추출을 사용할 수 있습니다. 얼음 차가운 물 1 mL을 추가하고 펠릿을 다시 일시 중단하고 다시 일시 중단 된 세포를 1.5 mL 마이크로 튜브로 옮김하십시오. 20,000 x g에서 4°C에서 10s에 원심분리기를 제거하고 상급체를 제거한다. AE 버퍼 400 μL을 추가하고 셀을 다시 일시 중단합니다.참고: 단계 4.4-4.15는 달리 명시되지 않는 한 실온에서 수행됩니다. 40 μL의 10% SDS와 400 μL의 산 페놀 (pH 4.5)을 추가합니다.주의 사항: 페놀은 독성이 있으며 연기 후드에서 처리해야합니다. 페놀로 작업할 때는 항상 실험실 코트, 보호 장갑 및 안경을 착용하십시오. 기관 규정에 따라 폐기물을 처리합니다. 20초 동안 소용돌이를 잘 섞으세요. 65 °C에서 10 분 동안 배양하십시오. 2분마다 튜브를 부드럽게 열고 닫아 압력을 풀어내고 튜브를 2-3회 뒤집어 위상을 혼합합니다. 튜브를 -80°C로 옮기고 10분 동안 배양합니다. 실온에서 5 분 동안 20,000 x g에서벤치와 원심 분리기에 튜브를 해동하십시오. 상부를 400 μL 산 페놀을 함유한 새로운 튜브로 옮김:클로로포름:이소아밀 알코올(25:24:1). 상호 단계를 방해하지 마십시오.주의 사항: 클로로포름은 독성이 있으며 연기 후드에서 처리해야 합니다. 클로로폼으로 작업할 때는 항상 실험실 코트, 보호 장갑 및 안경을 착용하십시오. 기관 규정에 따라 폐기물을 처리합니다. 실온에서 10 분 동안 20,000 x g에서 30 초및 원심 분리기를 소용돌이치면서 잘 섞습니다. 상부 상(~400 μL)을 400 μL 클로로포름을 함유하는 새로운 튜브로 옮니다. 실온에서 5분 동안 20,000 x g에서 30초와 원심분리기를 휘저음으로써 잘 섞으세요. 상층부(~300-350 μL)를 EtOH 1 mL 및 7.5 m 암모늄 아세테이트(NH4AC)의 40 μL을 포함하는 새로운 튜브로 옮니다. 튜브를 몇 번 뒤집어 섞으세요. -80°C에서 2시간 동안 또는 -20°C에서 하룻밤 동안 배양한다.참고: 절차는 여기에서 일시 중지할 수 있습니다. 20,000 x g에서원심 분리기, 4 °C에서 10 분 동안. 작은, 백색 RNA 펠릿은 관의 바닥에 보일 것입니다. 펠릿을 방해하지 않도록 파이펫팅하여 EtOH를 제거하십시오. 실온에서 5분 동안 20,000 x g에 70% EtOH 및 원심분리기 1mL를 추가합니다. 파이펫팅으로 70% EtOH를 제거합니다. 15s에 대해 20,000 x g의 원심분리기를 하고 2-20 μL 파이펫으로 나머지 EtOH를 제거합니다. 튜브를 벤치에 놓고 5 분 동안 열어 RNA 펠릿을 건조시면됩니다.참고: RNA 펠릿은 건조할 때 백색에서 투명으로 색상을 변경합니다. RNase/DNase-freeH2 O의30 μL에서 RNA 펠릿을 다시 중단하고, 얼음 위에 튜브를 즉시 옮기고 미세 스펙트로 광도계에서 RNA 농도를 측정합니다. 샘플을 -20°C에서 동결합니다.참고: RNA는 -20°C에서 최대 1개월, -80°C에서 최대 1년까지 보관할 수 있다. 프로시저는 여기에서 일시 중지하거나 다음 단계로 직접 진행할 수 있습니다. 5. DNAzyme 소화 10-23 DNAzyme 소화 1.5 mL 튜브에서 5 μg의 RNA, 10-23 DNAzyme의 200 pmol (100 mM 스톡 용액의 2 μL) 및 4 x 10-23 인큐베이션 버퍼의 2.5 μL을 총 부피10 μL의 양으로 결합하여 인큐베이션 혼합을 준비합니다. 튜브를 95°C로 설정된 건조한 열 블록으로 옮기고 3분 동안 배양합니다. 튜브를 얼음에 즉시 옮기고 5 분 동안 배양하십시오. 잠시 아래로 회전하고 다시 얼음에 튜브를 넣어. RNase 억제제 (예를 들어, 0.5 μL 리보록 RNase 억제제)의 20 U를 추가합니다. 튜브를 25°C로 설정된 마른 열 블록에 넣고 10분 동안 배양합니다. 한편, 반응 혼합물을 4x 10-23 반응 완충액 5 μL과 300 mM MgCl2 및 1 μL H2O의 4 μL과 결합하여 1.5 μL 튜브에 반응 혼합물을 37°C로 설정된 건조 블록에 놓는다. 인큐베이션 믹스를 37°C세트의 건조 히트 블록으로 옮기고 10 μL의 미리 온난반응 믹스를 첨가한다. 1 시간 동안 37 °C에서 반응을 배양합니다. 얼음에 튜브를 전송하고 단계 5.3.1로 진행합니다. 8-17 DNAzyme 소화 총 부피 6 μL의 RNA 5 μg로 1.5 mL 마이크로튜브를 준비합니다. 8-17 DNAzyme의 400 pmol (100 mM 재고 중 4 μL)으로 1.5 mL 마이크로 튜브를 준비하십시오. 튜브를 얼음 위에 두십시오. 튜브를 95°C에 설정된 건조한 열 블록으로 옮기고 2분 동안 배양합니다. 얼음에 RNA 샘플을 이동합니다. DNAzyme로 튜브를 5 초 동안 회전시키고 25 °C에서 10 분 동안 배양하십시오. 동시에, 2x 8-17 반응 완충제의 10 μL로 1.5 mL 튜브를 준비하고 25°C에서 배양한다. DNAzyme와 튜브에 미리 온화 된 2x 반응 버퍼의 10 μL을 추가하여 반응 혼합물을 준비합니다. RNA를 사용하여 튜브에 반응 혼합물의 14 μL을 전달하고 RNase 억제제의 20 U를 추가합니다. 25°C에서 2시간 동안 반응을 배양한다. 얼음에 튜브를 전송하고 RNA 정제를 진행 (단계 5.3.1). RNA 정제 350 μL의 물과 400 μL의 클로로포름을 반응 튜브에 넣고 실온에서 5 분 동안 20,000 x g에서 30 s와 원심 분리기를 소용돌이치면서 잘 섞습니다. 상부 단계(~300-350 μL)를 EtOH 1 mL, 7.5 M NH4AC의 40 μL 및 1 μL의 글리코겐(10 μg/μL)을 포함하는 새로운 튜브로 옮긴다. 튜브를 몇 번 뒤집어 섞으세요. -80°C에서 2시간 동안 또는 -20°C에서 하룻밤 동안 배양한다.참고: 절차는 여기에서 일시 중지할 수 있습니다. 4.15에서 4.21까지 단계를 반복합니다. RNase/DNase 프리H2O의 10 μL에서 RNA 펠릿을 다시 중단하고 튜브를 얼음 에 즉시 옮김을 옮김을 옮김. 샘플을 -20°C에서 동결합니다.참고: RNA는 -20°C에서 최대 1개월까지, -80°C에서 최대 1년까지 보관할 수 있다. 절차는 여기에서 일시 중지되거나 RNA 전기 동으로 진행할 수 있습니다. 6. RNA 전기 동아 전기 동공 장비 (탱크, 트레이, 빗)에 1 % SDS를 뿌리고 15 분 동안 방치하고 ddH2O를 충분히 헹구십시오. 127.5 mL의 ddH2O에 아가로즈 1.5 g을 전자레인지에 가열하여 용해시면 됩니다. 아가로즈 용액에 15 mL의 10x MOPS와 7.5 mL의 37 % 포름알데히드를 추가하십시오 (총 부피는 150 mL입니다).주의 사항: 포름알데히드는 독성이 있으며 연기 후드에서 처리해야합니다. 포름알데히드와 함께 작업할 때는 항상 실험실 코트, 보호 장갑 및 안경을 착용하십시오. 기관 규정에 따라 폐기물을 처리합니다. 아가로즈 용액에 선택의 겔 얼룩의 적당량을 첨가한다(예를 들어, 15 μL의 SYBR Safe DNA 겔 얼룩). 잘 섞어서 아가로즈를 트레이에 붓습니다. 즉시 젤에 빗을 삽입합니다. 연기 후드 아래에 45 분 동안 둡니다. 빛에 민감한 젤 얼룩을 사용할 때 는 알루미늄 호일로 트레이를 덮습니다. 1x MOPS 버퍼의 600mL를 준비합니다. RNA 샘플 준비 1.5 mL 튜브에서 소화 및 정제 RNA 샘플 10 μL, 시료 변성 완충제 5 μL 및 6x 로딩 염료0.5 μL을 결합합니다.주의 사항: 포르마미드는 독성이 있으며 연기 후드에서 처리해야 합니다. 포름아미드로 작업할 때는 항상 실험실 코트, 보호 장갑 및 안경을 착용하십시오. 기관 규정에 따라 폐기물을 처리합니다. 70 °C에서 5 분 동안 인큐베이션 RNA 샘플을 얼음에 옮기는다. 5 분 동안 배양하십시오. 젤에 적재하기 전에 잠시 아래로 돌입니다. 젤을 전기 동공 탱크에 넣고 1x MOPS 버퍼로 채웁니다. 각 샘플(15 μL)의 전체 부피를 겔에 로드합니다. 브로모페놀 블루가 젤 길이의 2/3에 도달할 때까지 80V에서 실행합니다. 선택한 겔 얼룩(예를 들어, UV 트랜스칠미네이터)을 검출하기에 적합한 이미저를 사용하여 겔을 이미지화한다.