KSHV感染细胞中特定基因产物的定量原位荧光杂交（FISH）和免疫荧光（IF）
Summary
我们描述了一种利用荧光原位杂交（FISH）来可视化被神经感染的人体细胞中的多种疱疹病毒RNA的协议，无论是悬浮的还是粘附的。该协议包括荧光的定量，产生核细胞质比，并可扩展用于同时可视化具有免疫荧光（IF）的宿主和病毒蛋白。
Abstract
机械洞察力来自对特定RNA和蛋白质的仔细研究和定量。这些生物分子在特定时间在整个细胞中的相对位置可以通过荧光原位杂交（FISH）和免疫荧光（IF）捕获。在溶性疱疹病毒感染过程中，病毒劫持宿主细胞以优先表达病毒基因，导致细胞形态和生物分子行为发生变化。Lytic 活动以核工厂为中心，称为病毒复制隔间，仅与 FISH 和 IF 一起可辨别。在这里，我们描述了一个适应RNA FISH和IF技术卡波西的肉瘤相关疱疹病毒（KSHV）感染细胞，无论是粘附的还是悬浮的。该方法包括特定抗感寡核苷酸、双RNA FISH、带IF的RNA FISH和荧光强度定量计算的步骤。该协议已成功应用于多种细胞类型、未感染细胞、潜伏细胞、溶酶细胞、时间过程和用抑制剂处理的细胞，以分析来自人类宿主和KSHV.
Introduction
在其溶性（活性）阶段，疱疹病毒劫持宿主细胞，导致细胞形态和生物分子的定位变化，以产生病毒。手术的基础是细胞核，其中双链DNA病毒基因组被复制并包装成一个蛋白质外壳，称为辣椒1。首先，病毒表达自己的蛋白质，劫持宿主机制，防止非必需宿主基因的表达，这个过程称为宿主关闭效应。这种活动的大部分被局部化为特定的4°，6-二酰胺-2-phenyinole（DAPI）无核区域称为病毒复制隔间，由宿主和病毒蛋白、RNA和病毒DNA2组成。细胞经过大修，为复制舱提供空间和资源，从而组装病毒辣椒。一旦辣椒离开细胞核，细胞质中如何包裹辣椒，产生膜结合的病毒颗粒，也称为病毒，目前还不清楚。了解宿主和病毒生物分子在溶质阶段中的定位和空间变化，有助于深入了解复制舱的排列、宿主关闭效应、病毒-出口通路和其他与疱疹病毒感染和复制相关的过程。
目前，检测和研究这些变化的最佳方法是分别对免疫荧光（IF）和荧光原位杂交（FISH）受感染细胞中的蛋白质和RNA进行可视化。使用这些技术的时间过程揭示了生物分子在lytic相的关键点或简单的时空数据的定位。FISH 和 IF 补充了其他生化技术，例如抑制细胞过程（例如抑制病毒DNA复制）、RT-qPCR（实时聚合酶链反应）、RNA 测序、北方印迹、质谱法、西方印迹和分析病毒DNA的产生，这可能提供一个更全球性的细胞活动图景。
我们开发了RNA FISH策略来检查来自特定基因的RNA产物，并进行了定量计算特定基因产物核细胞质比的计算分析。从Steitz和同事3，4的早期出版物中修改的样品制备相对容易，可用于粘附细胞和悬浮细胞。该协议还适用于同时使用多个RNA FISH策略（双RNA FISH）或RNA FISH与IF策略。制定具体的 FISH 战略具有挑战性，但概述了提高成功性的建议。如果使用荧光珠和隔间边界的强标记，并且提供对显微图的更多洞察，从而消除观测偏差，则此处描述的数据分析是定量的。详细方案是专为受卡波西肉瘤相关疱疹病毒（KSHV）感染的潜伏细胞和溶血细胞而设计的，可用于未感染的细胞或其他疱疹病毒感染的细胞5。定量方法适用于大多数细胞中核细胞质转移或亚细胞间重新定位的研究。
Protocol
Representative Results
Discussion
本报告中描述的方案可以适应不同的细胞类型，包括使用单克隆和多克隆原抗体的IF双RNA FISH和RNA FISH的步骤。虽然制备的幻灯片通常使用共聚焦显微镜进行成像，但经过抗体浓度增加和不同的安装介质的修改后，可以使用 STED（刺激发射消耗）显微镜进行成像。为了增强对单个细胞的分析，使用该协议制备的样品也可以由细胞分拣器或流动细胞仪进行分类、成像和分析，变化不大，如Borah及其<sup c…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢乔纳森·罗登费尔斯、卡齐米尔兹·泰科夫斯基和约翰娜·威瑟斯就数据分析提供建议。我们还感谢G.海沃德的抗SSB抗体。这项工作得到了国家卫生研究院（TKV）和NIH赠款（CA16038）（JAS）的T32GM007223和T32AI055403的资助。JAS是霍华德·休斯医学研究所的研究员。图1-3和表1经美国微生物学会许可转载，从以下出版物获得知识共享归因许可：瓦莱里、T.K.、威瑟斯、J.B.、安多、斯蒂茨、J.A.卡波西的《萨科马联系》核病毒中的疱疹病毒mRNA积累受病毒DNA复制和病毒非编码多基因化核RNA的影响。病毒学杂志。92 （13）， doi：10.1128/JVI.00220-18， （2018）。
Materials
| AlexaFluor594-5-dUTP | Life Technologies | C1100 | |
| anti-DIG FITC | Jackson Lab Immunologicals | 200-092-156 | |
| Anti-Rabbit Secondary AlexaFluor594 Monoclonal Antibody | Invitrogen | A-11037 | Goat |
| Anti-SSB Antibody | N/A | N/A | Ref. Chiou et al. 2002 |
| BLASTn | NIH NCBI | N/A | Free Sequence Alignment Software |
| Dextran Sulfate | Sigma Aldrich | D8906 | Molecular Biology Grade |
| DIG-Oligonucleotide Tailing Kit | Sigma Roche | #03353583910 | 2nd Gen |
| Eight-Chamber Slides | Nunc Lab Tek II | #154453 | Blue seal promotes surface tension but separation by clear gel is also available. |
| Formamide | Sigma Aldrich | F9037 | Molecular Biology Grade |
| GAPDH Probes | Stellaris | SMF-2019-1 | Compatible with protocol, Quasar 670 |
| ImageJ | NIH, Bethesda, MD | N/A | Free Image Analysis Software, [http:rsb.info.nih.gov/ij/] |
| OligoAnalyzer | IDT | N/A | Free Oligonucleotide Analyzer |
| pcDNA3 | Invitrogen | A-150228 | |
| pmaxGFP | Amaxa | VDF-1012 | |
| Poly L-Lysine | Sigma Aldrich | P8920 | |
| Terminal Transferase | Sigma Roche | #003333574001 | |
| Vanadyl Ribonucleoside Complexes | NEB | S1402S | |
| Vectashield | Vector Laboratories, Inc. | H-1000 | DAPI within the mounting media scatters the light and reduces contrast. |
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