대류 강화 전달을 통해 뮤린 뇌로 항체 전달
Summary
대류 강화 전달 (CED)은 큰 조직 볼륨의 직접 관류에 의해 뇌로 치료제의 효과적인 전달을 가능하게하는 방법입니다. 절차는 카테터와 최적화 된 주입 절차의 사용을 필요로한다. 이 프로토콜은 마우스 뇌로 항체의 CED에 대한 방법론을 설명합니다.
Abstract
대류 강화 전달 (CED)는 카테터 시스템을 사용하여 큰 뇌 볼륨의 효과적인 관류를 가능하게하는 신경 외과 기술입니다. 이러한 접근법은 혈액 뇌 장벽(BBB)을 우회하여 안전한 전달 방법을 제공하므로 BBB 투과성이 좋지 않은 치료제 또는 전신 노출이 바람직하지 않은 치료제(예를 들어 독성으로 인한 치료)를 허용합니다. CED는 카테터 설계, 주입 프로토콜 및 난간 특성의 최적화가 필요합니다. 이 프로토콜을 통해 우리는 마우스의 카우데이트 푸타멘내로 항체의 최대 20 μg를 포함하는 용액의 CED를 수행하는 방법을 기술한다. 그것은 단계 카테터의 준비를 설명하고, 시험관 내에서 시험하고 램핑 주입 프로그램을 사용하여 마우스에서 CED를 수행합니다. 프로토콜은 다른 주입 볼륨에 대해 쉽게 조절될 수 있으며 화학요법, 사이토카인, 바이러스 입자 및 리포좀을 포함한 다양한 트레이서 또는 약리활성 또는 비활성 물질을 주입하는데 사용할 수 있습니다.
Introduction
혈액 뇌 장벽 (BBB) 혈액 순환에서 중추 신 경계를 분리 하는 반 투과성 국경을 형성 (CNS). 그러나 치료와 함께 CNS에 도달하는 것은 뇌종양, 알츠하이머 병 (AD) 또는 파킨슨 병 (PD)과같은 다양한 질병의 맥락에서 필요하다 1. 이것은 새로운 치료법의 개발에 중요하게 되고, 특히 시험된 약물이 BBB 투과성이 좋지 않거나전신 노출이 위험한 독성으로 이어질 수 있는 경우 1,2. 임상적으로 사용된 항체 중 일부는 이러한 두 가지 특징을 모두 표시한다. 이 문제에 대한 해결책은 BBB 바로 뒤에 치료제를 전달하는 것입니다.
대류 강화 배달 (CED) 큰 두뇌 볼륨의 효과적인 관류를 가능하게 하는 신경 외과 기술입니다. 이것은 표적으로 한 지역에 하나 이상의 카테터를 외과적으로 설치함으로써 달성됩니다. 약물 적용 중에 카테터의 개구부에서 압력 구배가 형성되며, 이는 조직3,4에서난간 분산의 원동력이됩니다. 따라서 관류 범위 2,4,5를결정하는 확산 계수가 아닌 주입의 지속 시간입니다. 이는 종래의 확산기반 내뇌주사 방법2,6에비해 훨씬 더 큰 뇌부피에 대한 배음의 균일한 전달을 제공한다. 동시에,이 전달 양식은 조직 손상의 낮은 위험을 갖는다2. 따라서, CED는 CNS 종양의 치료를 위한 기존의 화학치료제의 안전하고 효과적인 투여를 가능하게 할 수 있으며, 다른 CNS 장애 2에서 면역조절제 또는 작용작용및 길항항체의 전달을 가능하게 할 수 있다2 ,7,8,9. CED는 현재 파킨슨 병, 알츠하이머 병뿐만 아니라 고급 신경교종 2, 7,8,10,11의치료법에서 테스트됩니다.
카테터 설계 및 주사 요법은 CED 10,12,13,14,15,16의결과에 영향을 미치는 가장 중요한 요인 중 하나입니다. 더욱이, 입자의 적당한 크기, 음이온 전하 및 낮은 조직 친화도 10,17을포함하는 난간내 특이적 물리화학적 특성을 요구한다. 이들 파라미터각각은2,10,17을표적으로 하는 뇌 영역의 조직학적 특징에 따라 잠재적으로 조정되어야 한다.
여기에서 우리는 마우스의 카우데이트 푸타멘 (striatum)으로 항체 용액의 CED를 수행하기위한 방법론을 설명합니다. 또한, 프로토콜은 실험실 설정에서 스텝 카테터의 준비를 포함, 시험관내에서 테스트 및 CED를 수행.
캐뉼라의 모양, 사용되는 재료 및 카테터 개구부 수(12,15,18,19,20)에 따라 문학에서 사용할 수있는 여러 카테터 디자인이있습니다. ,21,22. 우리는 무딘 말단 금속 바늘에서 1mm 돌출된 융합실리카 모세관으로 만든 스텝 카테터를 사용하고 있습니다. 이러한 카테터 설계는 연구실험실에서 쉽게 제조될 수 있으며, 생체내 뇌의 자렌치마(23)와 유사한 물리적 파라미터를 가진 아가로즈 블록을 시험관내에서 시험할 때 좋은 CED 결과를 재현할 수 있다.
또한, 우리는 생체 내에서 5 μL의 난파를 전달하기위한 램핑 요법을 구현합니다. 이러한 프로토콜에서 주사 속도는 0.2 μL / min에서 최대 0.8 μL / min로 증가하므로 카테터를 따라 소화기 역류의 기회와 조직 손상 의 위험을 최소화합니다16. 이 프로토콜을 사용하여, 우리는 11 분 30 초의 과정을 통해 PBS의 5 μL에서 항체의 최대 20 μg를 가진 마우스를 성공적으로 관리했습니다.
프로토콜은 다른 주입 볼륨또는 화학 요법, 사이토 카인, 바이러스 입자 또는 리포좀 2,10,14,18과 같은 다양한 다른 물질을 주입하기 위해 쉽게 조정할 수 있습니다. ,22. 항체의 인산완충식염수(PBS) 또는 인공 뇌척수액(aCSF) 용액에 비해 극히 다른 물리화학적 특성을 가진 침심물을 사용하는 경우 추가적인 검증 단계가 권장됩니다. 카테터 어셈블리, 검증 및 CED의 경우 일반 입체 프레임에 장착된 드릴 및 사출 유닛이 있는 입체 로봇을 사용하는 모든 단계를 설명합니다. 이 절차는 또한 설명된 유리 미세 시링거를 구동할 수 있는 프로그래밍 가능한 미세 주입 펌프에 연결된 수동 입체 프레임으로 수행될 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
대류 강화 된 배달, 또는 뇌에 압력 매개 약물 주입, 처음에 처음 제안 되었다 19903. 이 접근은 통제된 방식으로 혈액 두뇌 방벽 의 뒤에 큰 두뇌 양의 관류를 약속합니다2. 그러나, 지금까지, 몇몇 임상 시험은 임상 설치에 있는 CED가 기술적으로 요구하는 것으로 나타났기 때문에 부분적으로, 이 접근을 사용하여 수행되었습니다24,<sup cla…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 취리히 대학의 보조금에 의해 지원되었다 (FK-15-057), 의료 생물학 연구를위한 노바티스 재단 (16C231) 스위스 암 연구 (KFS-3852-02-2016, KFS-4146-02-2017) 요하네스 보름 버그와 다리 증거 (개념의 20B1 _177300) – 린다 셸해머.
Materials
| 10 μL syringe | Hamilton | 7635-01 | |
| 27 G blunt end needle | Hamilton | 7762-01 | |
| Agarose | Promega | V3121 | |
| Atipamezol | Janssen | ||
| Bone wax | Braun | 1029754 | |
| Buprenorphine | Indivior Schweiz AG | ||
| Carprofen | Pfizer AG | ||
| Dental drill bits, steel, size ISO 009 | Hager & Meisinger | 1RF009 | |
| Ethanol 100% | Reuss-Chemie AG | 179-VL03K-/1 | |
| Fentanyl | Helvepharm AG | ||
| FITC-Dextran, 2000 kDa | Sigma Aldrich | FD2000S | |
| Flumazenil | Labatec Pharma AG | ||
| Formaldehyde | Sigma Aldrich | F8775-500ML | |
| High viscosity cyanoacrylate glue | Migros | ||
| Iodine solution | Mundipharma | ||
| Medetomidin | Orion Pharma AG | ||
| Microforge | Narishige | MF-900 | |
| Midazolam | Roche Pharma AG | ||
| Ophthalmic ointment | Bausch + Lomb | Vitamin A Blache | |
| PBS | ThermoFischer Scientific | 10010023 | |
| Polyclonal goat anti-rat IgG (H+L) antibody coupled with Alexa Fluor 647 | Jackson Immuno | ||
| Scalpels | Braun | BB518 | |
| Silica tubing internal diameter 0.1 mm, wall thickness of 0.0325 mm | Postnova | Z-FSS-100165 | |
| Stereotactic frame for mice | Stoelting | 51615 | |
| Stereotactic robot | Neurostar | Drill and Injection Robot | |
| Succrose | Sigma Aldrich | S0389-500G | |
| Topical tissue adhesive | Zoetis | GLUture | |
| Trypan blue | ThermoFischer Scientific | 15250061 | |
| Water | Bichsel | 1000004 |
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