Expression rapide et efficace des protéines multiples dans les embryons aviaires à l'aide de l'électroporation de l'ARNm
Summary
Nous rapportons l’électroporation d’ARN messager (ARNm) comme méthode qui permet l’expression rapide et efficace des protéines multiples dans le système de modèle d’embryon de caille. Cette méthode peut être utilisée pour étiqueter les cellules fluorescentes et enregistrer leurs mouvements in vivo par microscopie en accéléré peu de temps après l’électroporation.
Abstract
Nous rapportons que l’électroporation d’ARNm permet aux protéines fluorescentes d’étiqueter les cellules dans les embryons vivants de caille plus rapidement et plus largement que l’électroporation d’ADN. L’efficacité de transfection élevée permet à au moins 4 ARNm distincts d’être co-transfectés avec une efficacité de 87 %. La plupart des ARNm électroporated sont dégradés au cours des 2 premiers heures post-électroporation, ce qui permet d’effectuer des expériences sensibles au temps dans l’embryon en développement. Enfin, nous décrivons comment imager dynamiquement les embryons vivants électroporated avec des ARNM qui codent diverses protéines fluorescentes ciblées sous-cellulaires.
Introduction
L’électroporation est une méthode de transfection physique qui utilise une impulsion électrique pour créer des pores transitoires dans la membrane plasmatique, permettant à des substances comme les acides nucléiques ou les produits chimiques de passer dans le cytosol. L’électroporation est largement utilisée pour délivrer de l’ADN dans les bactéries, les levures, les plantes et les cellules de mammifères1,2,3. Il est couramment utilisé pour introduire des charges utiles génétiques dans les cellules cibles et les tissus dans l’embryon aviaire en développement pour étudier le contrôle génétique du développement ou l’étiquetage des populations migrantes de cellules4,5,6, 7. Cependant, plusieurs limitations expérimentales existentégalement avec l’électroporation d’ADN 8. Par exemple, l’électroporation de l’ADN introduit souvent des nombres très variables de vecteurs d’expression par cellule, puis les ARNm et les protéines qu’ils codent. Cette variabilité peut conduire à une hétérogénéité cellulaire considérable qui complique à la fois l’analyse d’image et l’interprétation des données9,10. De plus, les protéines issues de l’électroporation de l’ADN commencent seulement à exprimer 3 h après l’électroporation et n’atteignent pas l’efficacité maximale du nombre cellulaire et de l’intensité de fluorescence jusqu’à 12 h, probablement en raison du temps nécessaire pour le transfert dans le noyau et compléter transcription et traduction in vivo11.
En revanche, la transfection d’ARNm a été effectivement utilisée dans une variété de systèmes modèles, y compris les ovocytes Xenopus laevis par microinjection12,13, reprogrammant les cellules souches humaines par transfection de lipofectamine d’ARNm14 , et électroporating cellules souches neurales récalcitrantes chez les souris adultes15. Nous avons testé la capacité de l’électroporation de l’ARNm à étiqueter efficacement les cellules au cours du développement embryonnaire aviaire précoce à l’aide de mARN synthétisés in vitro qui codent des protéines fluorescentes distinctes (F). Pour nos études, nous avons utilisé le vecteur pCS2MD, un vecteur d’expression polyvalent couramment utilisé pour exprimer des protéines dans les embryons de Xenopus et de poisson zèbre. Les promoteurs de la polymérase d’ARN SP6 et T7 dans le pCS2MD permettent la synthèse de l’ARNm et des protéines de tout gène cloné lorsqu’ils sont utilisés dans un système de transcription/traduction in vitro.
Ici, nous démontrons que l’électroporation d’ARNm permet l’expression rapide et efficace des protéines fluorescentes (FPs) dans les embryons de caille gastrulating. Nous avons conçu et généré de nombreux vecteurs d’expression utilisés dans ces études. Par exemple, nous avons sous-cloné le gène LifeAct-eGFP16 dans le vecteur pCS2MD17 pour l’exprimer du promoteur CMV et du promoteur SP6. Le gène inséré se trouve en aval du promoteur SP6 et en amont de la queue SV40 poly(A)18. Dans les embryons co-électroporated avec l’ARNm et l’ADN, les F codés des ARNm transcrits in vitro ont été détectés pour la première fois dans les 20 minutes de l’électroporation, tandis que les PF des vecteurs d’expression d’ADN n’ont été détectés qu’après 3 h. Plusieurs ARNm codant pour le nucléaire, Golgi, et Les protéines membranaires peuvent être électroporated dans un embryon simultanément, ayant pour résultat l’expression rapide et efficace des protéines multiples dans les cellules individuelles. Enfin, à l’aide d’un rétablissement in vivo de fluorescence après l’essai de photoblanchiment (FRAP), nous montrons qu’une majorité des ARNm électroporated se désintègrent dans les 2 h. Ainsi, la production initiale rapide de protéine combinée avec la nouvelle traduction limitée de protéine fait l’électroporation d’ARNm une technique valable quand le contrôle temporel de l’expression est nécessaire.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans ce protocole, nous avons fourni des instructions étape par étape sur la façon de micro-injecter et d’électroporate précisément l’ARNm dans les cellules des embryons de caille gazateurs. Nous avons démontré que l’électroporation de l’ARNm synthétisée in vitro permet une expression rapide et efficace des protéines fluorescentes (F) dans les embryons de caille gazateurs (figure2 et 3). La fluorescence de la protéine H2B-citrine traduite par des ARNm électropo…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions David Huss pour ses idées utiles sur ce travail. Ce travail a été soutenu en partie par la Rose Hills Foundation Summer Research Fellowship (2016-2018) et la bourse de recherche de premier cycle de l’USC Provost à M.T., le Saban Research Institute Intramural Training Pre-Doctoral Award to M.D., et l’Université de Southern California Undergraduate Research Associates Program award to R.L.
Materials
| BamHI-HF | New England Biolabs | R3136L | |
| BglII | New England Biolabs | R0144S | |
| BsrG1-HF | New England Biolabs | R3575S | |
| NotI-HF | New England Biolabs | R3189L | |
| SalI-HF | New England Biolabs | R3138L | |
| Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol | Thermo Fisher | 15593031 | |
| SP6 mMessage Machine in vitro transcription kit | Thermo Fisher | AM1340 | |
| Fast Green FCF | Sigma Aldrich | F7252 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | 93443 | 4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol, t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | 2-(4-Amidinophenyl)-6-indolecarbamidine dihydrochloride, 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride, DAPI dihydrochloride |
| Whatman No.1 filter paper | Sigma Aldrich | WHA1001125 | |
| glycerol | Sigma Aldrich | G9012 | |
| Urea | Sigma Aldrich | 51457 | |
| pmTurquoise2-Golgi | Addgene | 36205 | pmTurquoise2-Golgi was a gift from Dorus Gadella (Addgene plasmid # 36205 ; http://n2t.net/addgene:36205 ; RRID:Addgene_36205) |
| pmEGFP-N1-LifeAct | Nat. Methods 2008;5:605-7. PubMed ID: 18536722 | ||
| pCS2.Lifeact-mGFP | Addgene | This paper | |
| pCS.H2B-citrine | Addgene | 53752 | pCS-H2B-citrine was a gift from Sean Megason (Addgene plasmid # 53752 ; http://n2t.net/addgene:53752 ; RRID:Addgene_53752) |
| pCS.memb-mCherry | Addgene | #53750 | pCS-memb-mCherry was a gift from Sean Megason (Addgene plasmid # 53750 ; http://n2t.net/addgene:53750 ; RRID:Addgene_53750) |
| Zeiss LSM-780 inverted microscope | Carl Zeiss Microscopy GmbH | The LSM-780 is a confocal and multi-photon microscope that offers the sensitivity required for vital imaging work. Equipped with a motorized stage, an autofocus device, and a full stage-top blackout incubator, the 780 is an excellent microscope for high-end live cell/embryo imaging. The high-sensitivity 32-channel Quasar detector allows for spectral imaging, linear unmixing, and high color count (>4) image acquisition. Excitation can be performed with 6 lines single photon lasers (405, 458, 488, 514, 564 and 633 nm), Chameleon (Coherent) 2-photon laser (range from 690nm to 1000nm), and run with ZEN 2011 SP7 (Black) system software. | |
| CUY-21 EDIT in vivo electroporator | Bex Co., Ltd. | ||
| Platinum flat square electrode, side length 5 mm | Bex Co., Ltd. | LF701P5E | |
| Olympus MVX10 FL Stereo Microscope | Olympus LifeScience | ||
| XM10 Monochrome camera | Olympus LifeScience | ||
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) for HCR (10×, pH 7.4) | To prepare 1 L of a 10× stock solution, combine 80 g of NaCl (Sigma-Aldrich S3014), 2 g of KCl (Sigma-Aldrich P9541), 11.4 g of Na2HPO4 (anhydrous; Sigma-Aldrich S3264), and 2.7 g of KH2PO4 (anhydrous; Sigma-Aldrich P9791). Adjust the pH to 7.4 with HCl, and bring the final volume to 1 L with ultrapure H2O. Avoid using CaCl2 and MgCl2 in PBS for HCR. It is important that the PBS for HCR is prepared as an RNase-free solution (e.g., via diethylpyrocarbonate [DEPC] treatment). | ||
| 1.37 M NaCl | |||
| 27 mM KCl | |||
| 80 mM Na2HPO4 20 mM KH2PO4 | |||
| PBS/Triton | Add 1 mL of Triton X-100 (Sigma Aldrich 93443) and 100 mL of 10× PBS to 890 mL of ultrapure distilled H2O. Filter the solution through a 0.2-μm filter and store it at 4 ̊C until use. | ||
| 1× phosphate-buffered saline (PBS) (DEPC-treated; pH 7.4) | |||
| 0.1% Triton X-100 |
References
- Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. H. Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields. EMBO Journal. 1 (7), 841-845 (1982).
- Potter, H. Electroporation in biology: methods, applications, and instrumentation. Analytical Biochemistry. 174 (2), 361-373 (1988).
- Shillito, R. D., Saul, M. W., Paszkowski, J., Muller, M., Potrykus, I. High-Efficiency Direct Gene-Transfer to Plants. Bio-Technology. 3 (12), 1099-1103 (1985).
- Cui, C., Rongish, B., Little, C., Lansford, R. Ex Ovo Electroporation of DNA Vectors into Pre-gastrulation Avian Embryos. CSH Protocol. 2007 (24), 4894 (2007).
- Voiculescu, O., Papanayotou, C., Stern, C. D. Spatially and temporally controlled electroporation of early chick embryos. Nature Protocol. 3 (3), 419-426 (2008).
- Voiculescu, O., Stern, C. D. Manipulating Gene Expression in the Chick Embryo. Methods Molecular Biology. , 105-114 (2017).
- Chuai, M., et al. Cell movement during chick primitive streak formation. Developmental Bioliogy. 296 (1), 137-149 (2006).
- Krull, C. E. A primer on using in ovo electroporation to analyze gene function. Developmental Dynamics. 229 (3), 433-439 (2004).
- Momose, T., et al. Efficient targeting of gene expression in chick embryos by microelectroporation. Developmental, Growth and Differentiation. 41 (3), 335-344 (1999).
- Nakamura, H., Watanabe, Y., Funahashi, J. Misexpression of genes in brain vesicles by in ovo electroporation. Developmental, Growth and Differentiation. 42 (3), 199-201 (2000).
- Teddy, J. M., Lansford, R., Kulesa, P. M. Four-color, 4-D time-lapse confocal imaging of chick embryos. Biotechniques. 39 (5), 703-710 (2005).
- Green, M. R., Maniatis, T., Melton, D. A. Human beta-globin pre-mRNA synthesized in vitro is accurately spliced in Xenopus oocyte nuclei. Cell. 32 (3), 681-694 (1983).
- Mimoto, M. S., Christian, J. L. Manipulation of gene function in Xenopus laevis. Methods in Molecular Biology. 770, 55-75 (2011).
- Luni, C., et al. High-efficiency cellular reprogramming with microfluidics. Nature Methods. 13 (5), 446-452 (2016).
- Bugeon, S., et al. Direct and efficient transfection of mouse neural stem cells and mature neurons by in vivo mRNA electroporation. Development. 144 (21), 3968-3977 (2017).
- Riedl, J., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nature Methods. 5 (7), 605-607 (2008).
- Turner, D. L., Weintraub, H. Expression of achaete-scute homolog 3 in Xenopus embryos converts ectodermal cells to a neural fate. Genes and Development. 8 (12), 1434-1447 (1994).
- Krieg, P. A., Melton, D. A. Functional messenger RNAs are produced by SP6 in vitro transcription of cloned cDNAs. Nucleic Acids Research. 12 (18), 7057-7070 (1984).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
- Eyal-Giladi, H., Kochav, S. From cleavage to primitive streak formation: a complementary normal table and a new look at the first stage of the development of the chick. I. General morphology. Biologie du développement. 49, 321-337 (1976).
- Ainsworth, S. J., Stanley, R. L., Evans, D. J. Developmental stages of the Japanese quail. Journal of Anatomy. 216 (1), 3-15 (2010).
- Chapman, S. C., Collignon, J., Schoenwolf, G. C., Lumsden, A. Improved method for chick whole-embryo culture using a filter paper carrier. Developmental Dynamics. 220 (3), 284-289 (2001).
- Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nature Neurosciences. 14 (11), 1481-1488 (2011).
- New, D. A new technique for the cultivation of the chick embryo in vitro. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 3, 320-331 (1955).
- Drake, C. J., Davis, L. A., Hungerford, J. E., Little, C. D. Perturbation of beta 1 integrin-mediated adhesions results in altered somite cell shape and behavior. Biologie du développement. 149 (2), 327-338 (1992).
- Sato, Y., et al. Dynamic analysis of vascular morphogenesis using transgenic quail embryos. PLoS ONE. 5 (9), e12674 (2010).
- Kanda, T., Sullivan, K. F., Wahl, G. M. Histone-GFP fusion protein enables sensitive analysis of chromosome dynamics in living mammalian cells. Current Biology. 8 (7), 377-385 (1998).
- Uetrecht, A. C., Bear, J. E. Golgi polarity does not correlate with speed or persistence of freely migrating fibroblasts. European Journal of Cell Biology. 88 (12), 711-717 (2009).
- Alberts, B., et al. . Molecular Biology of the Cell. , (2007).
- Arndt-Jovin, D. J., Jovin, T. M. Fluorescence labeling and microscopy of DNA. Methods Cell Biol. 30, 417-448 (1989).
- Jovin, T. M., Arndt-Jovin, D. J. Luminescence digital imaging microscopy. Annu Rev Biophysics and Biophysical Chemistry. 18, 271-308 (1989).
- Heikal, A. A., Hess, S. T., Baird, G. S., Tsien, R. Y., Webb, W. W. Molecular spectroscopy and dynamics of intrinsically fluorescent proteins: coral red (dsRed) and yellow (Citrine). Proceedings of the National Academy of Science U S A. 97 (22), 11996-12001 (2000).
- Iizuka, R., Yamagishi-Shirasaki, M., Funatsu, T. Kinetic study of de novo chromophore maturation of fluorescent proteins. Analytical Biochemistry. 414 (2), 173-178 (2011).
- Nakamura, H., Katahira, T., Sato, T., Watanabe, Y., Funahashi, J. Gain- and loss-of-function in chick embryos by electroporation. Mechanism of Development. 121 (9), 1137-1143 (2004).
- Swartz, M., Eberhart, J., Mastick, G. S., Krull, C. E. Sparking new frontiers: using in vivo electroporation for genetic manipulations. Biologie du développement. 233 (1), 13-21 (2001).
- Meyer, S., Temme, C., Wahle, E. Messenger RNA turnover in eukaryotes: pathways and enzymes. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 39 (4), 197-216 (2004).
- Bevilacqua, P. C., Ritchey, L. E., Su, Z., Assmann, S. M. Genome-Wide Analysis of RNA Secondary Structure. Annual Review in Genetics. 50, 235-266 (2016).
- Harland, R., Misher, L. Stability of RNA in developing Xenopus embryos and identification of a destabilizing sequence in TFIIIA messenger RNA. Development. 102 (4), 837-852 (1988).
- Lippincott-Schwartz, J. The long road: peering into live cells. Nature Cell Biology. 12 (10), 918 (2010).
- Sato, Y., Lansford, R. Transgenesis and imaging in birds, and available transgenic reporter lines. Development Growth & Differentiation. 55 (4), 406-421 (2013).
- Goldman, R. D., Spector, D. L. . Live Cell Imaging: A Laboratory Manual. , (2005).
