JoVE Journal > Developmental Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biologie du développement

MRNA Electroporation kullanarak Avian embriyoları çoklu proteinlerin hızlı ve verimli Ifade

Published: June 07, 2019
doi:
10.3791/59664
, ,
1Department of Biological Sciences,University of Southern California, Los Angeles, 2Department of Radiology and Developmental Neuroscience Program, Saban Research Institute,Children’s Hospital Los Angeles, 3Keck School of Medicine, Department of Radiology,University of Southern California, Los Angeles

Summary

Biz bıldırcın embriyo modeli sistemde çoklu proteinlerin hızlı ve verimli ifade izin veren bir yöntem olarak haberci RNA (mRNA) elektroporasyonu rapor. Bu yöntem floresan hücreler için kullanılabilir ve Elektroporasyon kısa bir süre sonra zaman atlamalı mikroskopinin in vivo hareketlerini kaydetmek.

Abstract

MRNA Elektroporasyon ‘ın floresan proteinlerin, yaşayan bıldırcın embriyoları içinde DNA electroporasyon ‘dan daha hızlı ve geniş çapta hücreleri etiketlemesine izin verdiği bildiriyoruz. Yüksek transfeksiyon verimliliği, en az 4 farklı MRI ‘nin ~ 87% verimlilik ile ortak transfazine izin verir. Electroporated mRNAs ‘ların çoğu, ilk 2 h sonrası Elektroporasyon sırasında bozulur ve gelişmekte olan embriyonun içinde zaman duyarlı deneyler yapılacaktır. Son olarak, çeşitli hücresel hedeflenen floresan proteinleri kodlayan Mros ile electroporated canlı embriyolar dinamik görüntü nasıl açıklar.

Introduction

Electroporation plazma membranında geçici gözenekleri oluşturmak için bir elektrik darbe kullanan bir fiziksel transfeksiyon yöntemidir, nükselik asitler veya kimyasallar gibi maddelerin sitosol içine geçmek için izin. Electroporation yaygın bakteri, Maya, bitkiler ve memelilerin hücreleri1,2,3içine DNA teslim etmek için kullanılır. Gelişmekte olan kuş embriyo içindeki hedef hücrelere ve dokulara genetik yükleri tanıtmak için rutin olarak kullanılır ve hücre4,5,6, kalkınma veya etiket göç nüfusun genetik kontrolünü incelemek için 7‘ ye kadar. Ancak, DNA Elektroporasyon8ile birçok deneysel sınırlamalar da var. Örneğin, DNA Elektroporasyon genellikle hücre başına ifade vektörler son derece değişken sayılar tanıttı ve daha sonra mrnas ve onlar kodlamak proteinler. Bu değişkenlik, hem görüntü analizi hem de veri yorumlama9,10karmaşıklaşır önemli hücre hücresi heterojenite yol açabilir. Ayrıca, DNA Elektroporasyon proteinleri sadece ~ 3 h sonrası Elektroporasyon ifade etmeye başlar ve 12 h kadar hücre numarası ve floresan yoğunluğu maksimum verimlilik ulaşmaz, muhtemelen çekirdek içine aktarmak için gerekli zaman nedeniyle ve komple hem transkripsiyon ve tercüme vivo11.

Bunun aksine, mRNA transfeksiyon, Xenopus laevis oositler de dahil olmak üzere çeşitli model sistemlerinde etkili bir şekilde kullanılan12,13, mRNA lipofectamine transfeksiyon 14 tarafından insan kök hücrelerini yeniden programlama ve yetişkin fareler15‘ te realcitrant nöral kök hücrelerini electroporating. MRNA Elektroporasyon ‘ın, farklı floresan proteinlerini (FPs) kodlayan in vitro sentezlenmiş mrnas ‘ları kullanarak erken kuş embriyonik gelişiminde hücreleri etkili bir şekilde etiketlemeye yönelik yeteneğini test ettik. Çalışmalarımız için, Xenopus ve zebra balığı embriyoları proteinleri ifade etmek için yaygın olarak kullanılan pCS2 + vektörü, çok amaçlı bir ifade vektörü kullandık. PCS2 + ‘ da bulunan SP6 ve T7 RNA polimeraz promotörleri, bir in vitro transkripsiyon/çeviri sisteminde kullanıldığında klonlanmış genden mRNA ve proteinin sentezine izin verir.

Burada, mRNA elektroporasyonu, gastrulating bıldırcın embriyoları floresan proteinleri (FPs) hızlı ve verimli ifade sağlar göstermektedir. Bu çalışmalarda kullanılan ifade vektörler birçok tasarlanmış ve üretti. Örneğin, lifeact-EGFP geni16 ‘ nın pCS2 + vector17 ‘ sini CMV organizatör ve SP6 promotör ‘den ifade etmek için subklonladık. Eklenen gen, SP6 organizatör ve upstream bazılarında SV40 Poly (A) kuyruk18aşağı yatıyor. Embriyoların mRNA ve DNA ile birlikte electroporated, FPs içinde vitro transkripsiyonu mRNAs kodlanmış ilk 20 dk Electroporation içinde tespit edildi, DNA ifade vektörler FPs sadece sonra tespit edildi 3 h. nükleer, Golgi ve çok sayıda mRNAs kodlaması membran proteinleri aynı anda bir embriyo içine electroporated olabilir, bireysel hücrelerde çoklu proteinlerin hızlı ve verimli ifade sonucu. Son olarak, photobleaching (FRAP) tahlil sonra bir in vivo floresans kurtarma kullanarak, biz 2 saat içinde electroporated mRNAs çürümesi çoğunluğu gösterir. Böylece, sınırlı yeni protein çevirisi ile birlikte hızlı ilk protein üretimi mRNA Elektroporasyon ifade geçici kontrol gerektiğinde değerli bir teknik yapar.

Protocol

Tüm hayvan prosedürleri Los Angeles Çocuk Hastanesi ve Güney Kaliforniya Üniversitesi Kurumsal hayvan bakımı ve kullanım Komiteleri onaylı yönergelere uygun olarak gerçekleştirilmiştir. 1. Generation pCS2 tabanlı Ifade vektörler Klonlamak için pCS2. Lifeact-eGFP, vektör omurgasını hazırlamak 2 μg pCS2. CycB1-GFP (farklı bir ekleme içeren bir yapı) ile BamHI (10 U) ve Bsrgı (10 U) uygun sindirim tamponu (bkz. malzeme tablosu) Toplam reaksiyonda 1x sey…

Representative Results

mRNA Elektroporasyon DNA Elektroporasyon daha etkilidir Biz pCS2 + kullandık. H2B-Citrine in vitro transkripsiyonu mRNA hazırlamak için. DNA elektroporasyonu genellikle 1-2 μg/μL ‘de gerçekleştirildiği için, mRNA elektroporasyonu için (H2B-Citrine için 0.25-0.5 μg/μL civarında olmak üzere hesaplanan) mRNA equimolar konsantrasyonu kullandık. İlk olarak pCS2 + ‘ nın Elektroporasyon verimliliğini…

Discussion

Bu protokolde, biz nasıl tam mikroenjeksiyon ve elektrostatik bıldırcın embriyoları hücrelerine mRNA electroporate hakkında adım adımı talimatlar sağladı. İn vitro sentezlenmiş mRNA elektroporasyonu, gastrulating bıldırcın embriyoları içinde floresan proteinlerin (FPs) hızlı ve verimli bir şekilde ifade edilmesini sağlar (Şekil 2 ve 3). Electroporated mRNAs ‘dan çevrilmiş H2B-Citrine proteininden floresans, ~ 20 dakika içinde Konfokal mikroskobik t…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Biz bu işe yardımcı bilgiler için David Huss teşekkür ederiz. Bu çalışma tarafından kısmen desteklenmektedir Rose Hills Vakfı yaz Araştırma Bursu (2016-2018) ve USC Provost ‘s Altgrad araştırma bursu MT, saban Araştırma Enstitüsü Intramural eğitim doktora öncesi Ödülü MD, ve Üniversitesi Güney Kaliforniya lisans araştırma Associates programı Ödülü ı.

Materials

BamHI-HF New England Biolabs R3136L
BglII New England Biolabs R0144S
BsrG1-HF New England Biolabs R3575S
NotI-HF New England Biolabs R3189L
SalI-HF New England Biolabs R3138L
Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol Thermo Fisher 15593031
SP6 mMessage Machine in vitro transcription kit Thermo Fisher AM1340
Fast Green FCF Sigma Aldrich F7252
Triton X-100 Sigma Aldrich 93443 4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol, t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether
DAPI Sigma Aldrich D9542 2-(4-Amidinophenyl)-6-indolecarbamidine dihydrochloride, 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride, DAPI dihydrochloride
Whatman No.1 filter paper Sigma Aldrich WHA1001125
glycerol Sigma Aldrich G9012
Urea Sigma Aldrich 51457
pmTurquoise2-Golgi Addgene 36205 pmTurquoise2-Golgi was a gift from Dorus Gadella (Addgene plasmid # 36205 ; http://n2t.net/addgene:36205 ; RRID:Addgene_36205)
pmEGFP-N1-LifeAct Nat. Methods 2008;5:605-7. PubMed ID: 18536722
pCS2.Lifeact-mGFP Addgene This paper
pCS.H2B-citrine Addgene 53752 pCS-H2B-citrine was a gift from Sean Megason (Addgene plasmid # 53752 ; http://n2t.net/addgene:53752 ; RRID:Addgene_53752)
pCS.memb-mCherry Addgene #53750 pCS-memb-mCherry was a gift from Sean Megason (Addgene plasmid # 53750 ; http://n2t.net/addgene:53750 ; RRID:Addgene_53750)
Zeiss LSM-780 inverted microscope Carl Zeiss Microscopy GmbH The LSM-780 is a confocal and multi-photon microscope that offers the sensitivity required for vital imaging work. Equipped with a motorized stage, an autofocus device, and a full stage-top blackout incubator, the 780 is an excellent microscope for high-end live cell/embryo imaging. The high-sensitivity 32-channel Quasar detector allows for spectral imaging, linear unmixing, and high color count (>4) image acquisition. Excitation can be performed with 6 lines single photon lasers (405, 458, 488, 514, 564 and 633 nm), Chameleon (Coherent) 2-photon laser (range from 690nm to 1000nm), and run with ZEN 2011 SP7 (Black) system software.
CUY-21 EDIT in vivo electroporator Bex Co., Ltd.
Platinum flat square electrode, side length 5 mm Bex Co., Ltd. LF701P5E
Olympus MVX10 FL Stereo Microscope Olympus LifeScience
XM10 Monochrome camera Olympus LifeScience
Phosphate-Buffered Saline (PBS) for HCR (10×, pH 7.4) To prepare 1 L of a 10× stock solution, combine 80 g of NaCl (Sigma-Aldrich S3014), 2 g of KCl (Sigma-Aldrich P9541), 11.4 g of Na2HPO4 (anhydrous; Sigma-Aldrich S3264), and 2.7 g of KH2PO4 (anhydrous; Sigma-Aldrich P9791). Adjust the pH to 7.4 with HCl, and bring the final volume to 1 L with ultrapure H2O. Avoid using CaCl2 and MgCl2 in PBS for HCR. It is important that the PBS for HCR is prepared as an RNase-free solution (e.g., via diethylpyrocarbonate [DEPC] treatment).
1.37 M NaCl
27 mM KCl
80 mM Na2HPO4 20 mM KH2PO4
PBS/Triton Add 1 mL of Triton X-100 (Sigma Aldrich 93443) and 100 mL of 10× PBS to 890 mL of ultrapure distilled H2O. Filter the solution through a 0.2-μm filter and store it at 4 ̊C until use.
1× phosphate-buffered saline (PBS) (DEPC-treated; pH 7.4)
0.1% Triton X-100
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. H. Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields. EMBO Journal. 1 (7), 841-845 (1982).
  2. Potter, H. Electroporation in biology: methods, applications, and instrumentation. Analytical Biochemistry. 174 (2), 361-373 (1988).
  3. Shillito, R. D., Saul, M. W., Paszkowski, J., Muller, M., Potrykus, I. High-Efficiency Direct Gene-Transfer to Plants. Bio-Technology. 3 (12), 1099-1103 (1985).
  4. Cui, C., Rongish, B., Little, C., Lansford, R. Ex Ovo Electroporation of DNA Vectors into Pre-gastrulation Avian Embryos. CSH Protocol. 2007 (24), 4894 (2007).
  5. Voiculescu, O., Papanayotou, C., Stern, C. D. Spatially and temporally controlled electroporation of early chick embryos. Nature Protocol. 3 (3), 419-426 (2008).
  6. Voiculescu, O., Stern, C. D. Manipulating Gene Expression in the Chick Embryo. Methods Molecular Biology. , 105-114 (2017).
  7. Chuai, M., et al. Cell movement during chick primitive streak formation. Developmental Bioliogy. 296 (1), 137-149 (2006).
  8. Krull, C. E. A primer on using in ovo electroporation to analyze gene function. Developmental Dynamics. 229 (3), 433-439 (2004).
  9. Momose, T., et al. Efficient targeting of gene expression in chick embryos by microelectroporation. Developmental, Growth and Differentiation. 41 (3), 335-344 (1999).
  10. Nakamura, H., Watanabe, Y., Funahashi, J. Misexpression of genes in brain vesicles by in ovo electroporation. Developmental, Growth and Differentiation. 42 (3), 199-201 (2000).
  11. Teddy, J. M., Lansford, R., Kulesa, P. M. Four-color, 4-D time-lapse confocal imaging of chick embryos. Biotechniques. 39 (5), 703-710 (2005).
  12. Green, M. R., Maniatis, T., Melton, D. A. Human beta-globin pre-mRNA synthesized in vitro is accurately spliced in Xenopus oocyte nuclei. Cell. 32 (3), 681-694 (1983).
  13. Mimoto, M. S., Christian, J. L. Manipulation of gene function in Xenopus laevis. Methods in Molecular Biology. 770, 55-75 (2011).
  14. Luni, C., et al. High-efficiency cellular reprogramming with microfluidics. Nature Methods. 13 (5), 446-452 (2016).
  15. Bugeon, S., et al. Direct and efficient transfection of mouse neural stem cells and mature neurons by in vivo mRNA electroporation. Development. 144 (21), 3968-3977 (2017).
  16. Riedl, J., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nature Methods. 5 (7), 605-607 (2008).
  17. Turner, D. L., Weintraub, H. Expression of achaete-scute homolog 3 in Xenopus embryos converts ectodermal cells to a neural fate. Genes and Development. 8 (12), 1434-1447 (1994).
  18. Krieg, P. A., Melton, D. A. Functional messenger RNAs are produced by SP6 in vitro transcription of cloned cDNAs. Nucleic Acids Research. 12 (18), 7057-7070 (1984).
  19. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
  20. Eyal-Giladi, H., Kochav, S. From cleavage to primitive streak formation: a complementary normal table and a new look at the first stage of the development of the chick. I. General morphology. Biologie du développement. 49, 321-337 (1976).
  21. Ainsworth, S. J., Stanley, R. L., Evans, D. J. Developmental stages of the Japanese quail. Journal of Anatomy. 216 (1), 3-15 (2010).
  22. Chapman, S. C., Collignon, J., Schoenwolf, G. C., Lumsden, A. Improved method for chick whole-embryo culture using a filter paper carrier. Developmental Dynamics. 220 (3), 284-289 (2001).
  23. Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nature Neurosciences. 14 (11), 1481-1488 (2011).
  24. New, D. A new technique for the cultivation of the chick embryo in vitro. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 3, 320-331 (1955).
  25. Drake, C. J., Davis, L. A., Hungerford, J. E., Little, C. D. Perturbation of beta 1 integrin-mediated adhesions results in altered somite cell shape and behavior. Biologie du développement. 149 (2), 327-338 (1992).
  26. Sato, Y., et al. Dynamic analysis of vascular morphogenesis using transgenic quail embryos. PLoS ONE. 5 (9), e12674 (2010).
  27. Kanda, T., Sullivan, K. F., Wahl, G. M. Histone-GFP fusion protein enables sensitive analysis of chromosome dynamics in living mammalian cells. Current Biology. 8 (7), 377-385 (1998).
  28. Uetrecht, A. C., Bear, J. E. Golgi polarity does not correlate with speed or persistence of freely migrating fibroblasts. European Journal of Cell Biology. 88 (12), 711-717 (2009).
  29. Alberts, B., et al. . Molecular Biology of the Cell. , (2007).
  30. Arndt-Jovin, D. J., Jovin, T. M. Fluorescence labeling and microscopy of DNA. Methods Cell Biol. 30, 417-448 (1989).
  31. Jovin, T. M., Arndt-Jovin, D. J. Luminescence digital imaging microscopy. Annu Rev Biophysics and Biophysical Chemistry. 18, 271-308 (1989).
  32. Heikal, A. A., Hess, S. T., Baird, G. S., Tsien, R. Y., Webb, W. W. Molecular spectroscopy and dynamics of intrinsically fluorescent proteins: coral red (dsRed) and yellow (Citrine). Proceedings of the National Academy of Science U S A. 97 (22), 11996-12001 (2000).
  33. Iizuka, R., Yamagishi-Shirasaki, M., Funatsu, T. Kinetic study of de novo chromophore maturation of fluorescent proteins. Analytical Biochemistry. 414 (2), 173-178 (2011).
  34. Nakamura, H., Katahira, T., Sato, T., Watanabe, Y., Funahashi, J. Gain- and loss-of-function in chick embryos by electroporation. Mechanism of Development. 121 (9), 1137-1143 (2004).
  35. Swartz, M., Eberhart, J., Mastick, G. S., Krull, C. E. Sparking new frontiers: using in vivo electroporation for genetic manipulations. Biologie du développement. 233 (1), 13-21 (2001).
  36. Meyer, S., Temme, C., Wahle, E. Messenger RNA turnover in eukaryotes: pathways and enzymes. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 39 (4), 197-216 (2004).
  37. Bevilacqua, P. C., Ritchey, L. E., Su, Z., Assmann, S. M. Genome-Wide Analysis of RNA Secondary Structure. Annual Review in Genetics. 50, 235-266 (2016).
  38. Harland, R., Misher, L. Stability of RNA in developing Xenopus embryos and identification of a destabilizing sequence in TFIIIA messenger RNA. Development. 102 (4), 837-852 (1988).
  39. Lippincott-Schwartz, J. The long road: peering into live cells. Nature Cell Biology. 12 (10), 918 (2010).
  40. Sato, Y., Lansford, R. Transgenesis and imaging in birds, and available transgenic reporter lines. Development Growth & Differentiation. 55 (4), 406-421 (2013).
  41. Goldman, R. D., Spector, D. L. . Live Cell Imaging: A Laboratory Manual. , (2005).

Tags

MRNA ElectroporationAvian EmbryoProtein ExpressionFluorescent ProteinsTransient TransfectionDevelopmental StageElectroporation ChamberEpiblastVitelline MembraneFluorescent Imaging

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Tran, M., Dave, M., Lansford, R. Fast and Efficient Expression of Multiple Proteins in Avian Embryos Using mRNA Electroporation. J. Vis. Exp. (148), e59664, doi:10.3791/59664 (2019).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image