Schnelle und effiziente Expression mehrerer Proteine in Aviären Embryonen mit mRNA-Elektroporation
Summary
Wir berichten von der Botal-RNA-Elektroporation (mRNA) als methode, die eine schnelle und effiziente Expression mehrerer Proteine im Wachtel-Embryo-Modellsystem ermöglicht. Diese Methode kann verwendet werden, um Zellen fluoreszierend zu kennzeichnen und ihre In-vivo-Bewegungen durch Zeitraffermikroskopie kurz nach der Elektroporation aufzuzeichnen.
Abstract
Wir berichten, dass die mRNA-Elektroporation fluoreszierende Proteine ermöglicht, Zellen in lebenden Wachtelembryonen schneller und breiter zu kennzeichnen als DNA-Elektroporation. Die hohe Transfektionseffizienz ermöglicht es, mindestens 4 verschiedene mRNAs mit einer Effizienz von 87 % zu transfizieren. Die meisten elektroporated mRNAs werden während der ersten 2 h Nachelektroporation abgebaut, so dass zeitempfindliche Experimente am sich entwickelnden Embryo durchgeführt werden können. Schließlich beschreiben wir, wie man lebende Embryonen dynamisch mit mRNAs elektropoliert, die verschiedene subzelluläre zielgerichtete fluoreszierende Proteine kodieren.
Introduction
Elektroporation ist ein physikalisches Transfektionsverfahren, das einen elektrischen Impuls verwendet, um transiente Poren in der Plasmamembran zu erzeugen, wodurch Substanzen wie Nukleinsäuren oder Chemikalien in das Zytosol gelangen können. Elektroporation ist weit verbreitet, um DNA in Bakterien, Hefe, Pflanzen und Säugetierzellen zu liefern1,2,3. Es wird routinemäßig verwendet, um genetische Nutzlasten in Zielzellen und Gewebe innerhalb des sich entwickelnden Aviären Embryos einzuführen, um die genetische Kontrolle der Entwicklung zu untersuchen oder wandernde Populationen der Zellen4,5,6, 7. Allerdings gibt es auch bei der DNA-Elektroporation8mehrere experimentelle Einschränkungen. Zum Beispiel führt die DNA-Elektroporation oft eine sehr variable Anzahl von Expressionsvektoren pro Zelle und anschließend die von ihnen kodierenden mRNAs und Proteine ein. Diese Variabilität kann zu einer erheblichen Zell-Zell-Heterogenität führen, die sowohl die Bildanalyse als auch die Dateninterpretation9,10erschwert. Darüber hinaus beginnen Proteine aus der DNA-Elektroporation erst nach der Elektroporation 3 h auszudrücken und erreichen erst 12 h die maximale Effizienz der Zellzahl und Fluoreszenzintensität, wahrscheinlich aufgrund der Zeit, die für die Übertragung in den Kern und die vollständige Transkription und Übersetzung in vivo11.
Im Gegensatz dazu wurde die mRNA-Transfektion effektiv in einer Vielzahl von Modellsystemen eingesetzt, einschließlich Xenopus laevis Oozyten durch Mikroinjektion12,13, Umprogrammierung menschlicher Stammzellen durch mRNA Lipofectamin-Transfektion14 , und elektroporating widerspenstigen neuronalen Stammzellen bei erwachsenen Mäusen15. Wir testeten die Fähigkeit der mRNA-Elektroporation, Zellen während der frühen aviären embryonalen Entwicklung effizient zu kennzeichnen, indem wir in vitro synthetisierte mRNAs verwenden, die verschiedene fluoreszierende Proteine (FPs) kodieren. Für unsere Studien verwendeten wir den pCS2+-Vektor, einen Mehrzweckexpressionsvektor, der häufig zum Extieren von Proteinen in Xenopus- und Zebrafischembryonen verwendet wird. Die SP6- und T7-RNA-Polymerase-Promotoren im pCS2+ ermöglichen die Synthese von mRNA und Protein aus jedem geklonten Gen, wenn sie in einem In-vitro-Transkriptions-/Translationssystem verwendet werden.
Hier zeigen wir, dass die mRNA-Elektroporation eine schnelle und effiziente Expression fluoreszierender Proteine (FPs) in gastrulating quail embryos ermöglicht. Wir haben viele der in diesen Studien verwendeten Expressionsvektoren entwickelt und generiert. Zum Beispiel haben wir das LifeAct-eGFP-Gen16 in den pCS2+ Vektor17 subkloniert, um es vom CMV-Promotor und SP6-Promoter auszudrücken. Das eingefügte Gen liegt flussabwärts des SP6-Promotors und vor dem SV40-Poly(A)-Schwanz18. Bei Embryonen, die mit mRNA und DNA kopodiert wurden, wurden FPs, die aus in vitro transkribierten mRNAs kodiert wurden, erstmals innerhalb von 20 min elektroporation nachgewiesen, während FPs aus DNA-Expressionsvektoren erst nach 3 h nachgewiesen wurden. Membranproteine können gleichzeitig zu einem Embryo elektropoiert werden, was zu einer schnellen und effizienten Expression mehrerer Proteine in einzelnen Zellen führt. Schließlich zeigen wir mit einer In-vivo-Fluoreszenz-Wiederherstellung nach Photobleicharbeiten (FRAP) Assay, dass ein Großteil der elektroporated mRNAs innerhalb von 2 h zerfällt. So macht eine schnelle anfängliche Proteinproduktion in Kombination mit einer begrenzten neuen Proteintranslation die mRNA-Elektroporation zu einer wertvollen Technik, wenn eine zeitliche Kontrolle der Expression notwendig ist.
Protocol
Representative Results
Discussion
In diesem Protokoll haben wir Schritt für Schritt Anleitungen gegeben, wie man mRNA präzise in die Zellen von gastrulating quail embryos injizieren und elektroporate. Wir haben gezeigt, dass in vitro synthetisierte mRNA-Elektroporation eine schnelle und effiziente Expression fluoreszierender Proteine (FPs) in gastrulating quail embryos ermöglicht (Abbildung 2 und 3). Fluoreszenz aus H2B-Citrin-Protein, das aus elektroporated mRNAs übersetzt wurde, konnte durch konfokale …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken David Huss für die hilfreichen Einblicke in diese Arbeit. Diese Arbeit wurde teilweise durch das Rose Hills Foundation Summer Research Fellowship (2016-2018) und das USC Provost es Undergrad Research Fellowship an M.T., das Saban Research Institute Intramural Training Pre-Doctoral Award an M.D. und die University of Southern California Undergraduate Research Associates Program Award an R.L.
Materials
| BamHI-HF | New England Biolabs | R3136L | |
| BglII | New England Biolabs | R0144S | |
| BsrG1-HF | New England Biolabs | R3575S | |
| NotI-HF | New England Biolabs | R3189L | |
| SalI-HF | New England Biolabs | R3138L | |
| Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol | Thermo Fisher | 15593031 | |
| SP6 mMessage Machine in vitro transcription kit | Thermo Fisher | AM1340 | |
| Fast Green FCF | Sigma Aldrich | F7252 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | 93443 | 4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol, t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | 2-(4-Amidinophenyl)-6-indolecarbamidine dihydrochloride, 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride, DAPI dihydrochloride |
| Whatman No.1 filter paper | Sigma Aldrich | WHA1001125 | |
| glycerol | Sigma Aldrich | G9012 | |
| Urea | Sigma Aldrich | 51457 | |
| pmTurquoise2-Golgi | Addgene | 36205 | pmTurquoise2-Golgi was a gift from Dorus Gadella (Addgene plasmid # 36205 ; http://n2t.net/addgene:36205 ; RRID:Addgene_36205) |
| pmEGFP-N1-LifeAct | Nat. Methods 2008;5:605-7. PubMed ID: 18536722 | ||
| pCS2.Lifeact-mGFP | Addgene | This paper | |
| pCS.H2B-citrine | Addgene | 53752 | pCS-H2B-citrine was a gift from Sean Megason (Addgene plasmid # 53752 ; http://n2t.net/addgene:53752 ; RRID:Addgene_53752) |
| pCS.memb-mCherry | Addgene | #53750 | pCS-memb-mCherry was a gift from Sean Megason (Addgene plasmid # 53750 ; http://n2t.net/addgene:53750 ; RRID:Addgene_53750) |
| Zeiss LSM-780 inverted microscope | Carl Zeiss Microscopy GmbH | The LSM-780 is a confocal and multi-photon microscope that offers the sensitivity required for vital imaging work. Equipped with a motorized stage, an autofocus device, and a full stage-top blackout incubator, the 780 is an excellent microscope for high-end live cell/embryo imaging. The high-sensitivity 32-channel Quasar detector allows for spectral imaging, linear unmixing, and high color count (>4) image acquisition. Excitation can be performed with 6 lines single photon lasers (405, 458, 488, 514, 564 and 633 nm), Chameleon (Coherent) 2-photon laser (range from 690nm to 1000nm), and run with ZEN 2011 SP7 (Black) system software. | |
| CUY-21 EDIT in vivo electroporator | Bex Co., Ltd. | ||
| Platinum flat square electrode, side length 5 mm | Bex Co., Ltd. | LF701P5E | |
| Olympus MVX10 FL Stereo Microscope | Olympus LifeScience | ||
| XM10 Monochrome camera | Olympus LifeScience | ||
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) for HCR (10×, pH 7.4) | To prepare 1 L of a 10× stock solution, combine 80 g of NaCl (Sigma-Aldrich S3014), 2 g of KCl (Sigma-Aldrich P9541), 11.4 g of Na2HPO4 (anhydrous; Sigma-Aldrich S3264), and 2.7 g of KH2PO4 (anhydrous; Sigma-Aldrich P9791). Adjust the pH to 7.4 with HCl, and bring the final volume to 1 L with ultrapure H2O. Avoid using CaCl2 and MgCl2 in PBS for HCR. It is important that the PBS for HCR is prepared as an RNase-free solution (e.g., via diethylpyrocarbonate [DEPC] treatment). | ||
| 1.37 M NaCl | |||
| 27 mM KCl | |||
| 80 mM Na2HPO4 20 mM KH2PO4 | |||
| PBS/Triton | Add 1 mL of Triton X-100 (Sigma Aldrich 93443) and 100 mL of 10× PBS to 890 mL of ultrapure distilled H2O. Filter the solution through a 0.2-μm filter and store it at 4 ̊C until use. | ||
| 1× phosphate-buffered saline (PBS) (DEPC-treated; pH 7.4) | |||
| 0.1% Triton X-100 |
References
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