JoVE Journal > Developmental Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biologie du développement

Snelle en efficiënte expressie van meervoudige eiwitten in aviaire embryo's met behulp van mRNA-Elektroporation

Published: June 07, 2019
doi:
10.3791/59664
, ,
1Department of Biological Sciences,University of Southern California, Los Angeles, 2Department of Radiology and Developmental Neuroscience Program, Saban Research Institute,Children’s Hospital Los Angeles, 3Keck School of Medicine, Department of Radiology,University of Southern California, Los Angeles

Summary

We rapporteren boodschapper RNA (mRNA) electroporatie als een methode die snelle en efficiënte expressie van meerdere eiwitten in het kwartel embryo modelsysteem toestaat. Deze methode kan worden gebruikt om cellen fluorescentend te labelen en hun in vivo bewegingen op te nemen door middel van timelapse-microscopie kort na elektroporation.

Abstract

We melden dat mRNA-elektroporation fluorescerende eiwitten toelaat om cellen in levende kwartel embryo’s sneller en in het algemeen te labelen dan DNA-elektroporation. De hoge transfectie-efficiëntie maakt het mogelijk om ten minste 4 verschillende Mrna’s te co-transport met ~ 87% efficiëntie. De meeste van de elektroporated Mrna’s worden afgebroken tijdens de eerste 2 h post-elektroporation, waardoor tijdgevoelige experimenten kunnen worden uitgevoerd in het zich ontwikkelende embryo. Ten slotte beschrijven we hoe u dynamische beelden van levende embryo’s elektroporated met Mrna’s die verschillende subcellulaire gerichte fluorescerende eiwitten coderen.

Introduction

Elektroporation is een fysieke transfectie methode die een elektrische puls gebruikt om voorbijgaande poriën in het plasma membraan te creëren, waardoor stoffen zoals nucleïnezuren of chemicaliën in de cytosol kunnen overgaan. Elektroporation wordt veel gebruikt om DNA te leveren in bacteriën, gist, planten en zoogdiercellen1,2,3. Het wordt routinematig gebruikt om genetische ladingen in doelcellen en weefsels in te voeren binnen het ontwikkelende aviaire embryo om de genetische controle van de ontwikkeling of de migratie populaties van cellen4,5,6te bestuderen, 7. Er bestaan echter ook verschillende experimentele beperkingen met DNA-elektroporation8. DNA-elektroporation introduceert bijvoorbeeld vaak zeer variabele aantallen expressie vectoren per cel en vervolgens de Mrna’s en eiwitten die ze coderen. Deze variabiliteit kan leiden tot een aanzienlijke celcellige heterogeniteit die zowel beeldanalyse als gegevens interpretatie van9,10compliceert. Bovendien beginnen eiwitten van DNA-elektroporation slechts ~ 3 h post-elektroporation en bereiken ze niet de maximale efficiëntie in het aantal cellen en de intensiteit van de fluorescentie tot 12 uur, waarschijnlijk als gevolg van de tijd die nodig is om over te brengen in de Nucleus en volledige zowel transcriptie als vertaling in vivo11.

MRNA transfectie is daarentegen effectief gebruikt in een verscheidenheid van modelsystemen, waaronder Xenopus laevis oocyten door Microinjection12,13, herprogrammatie menselijke stamcellen door mRNA lipofectamine transfectie14 , en elektroporerende recalcitrante neurale stamcellen bij volwassen muizen15. We testten het vermogen van mRNA electroporatie om cellen efficiënt te labelen tijdens de vroege aviaire embryonale ontwikkeling met behulp van in vitro gesynthetiseerde mrna’s die verschillende fluorescerende eiwitten (fps) coderen. Voor onze studies gebruikten we de pCS2 + vector, een multifunctionele expressie vector die vaak wordt gebruikt voor het uitdrukken van eiwitten in Xenopus en zebravis embryo’s. De SP6 en T7-RNA-polymerase bevorderaar in de pCS2 + staan de synthese toe van mRNA en eiwitten uit elk gekloond gen bij gebruik in een in vitro transcriptie/vertaalsysteem.

Hier tonen we aan dat mRNA electroporatie een snelle en efficiënte expressie van fluorescerende eiwitten (fps) in gastrulerende kwartel embryo’s mogelijk maakt. We ontwierpen en genereerden veel van de expressie vectoren die in deze studies werden gebruikt. Zo hebben we de LifeAct-eGFP Gene16 in de pCS2 + Vector17 gesubgekloond om uit te drukken van de promotor en de SP6 Promoter van CMV. Het ingebrachte gen ligt stroomafwaarts van de SP6 promoter en stroomopwaarts van de SV40 poly (A) tail18. In embryo’s co-elektroporated met mRNA en DNA, FPs gecodeerd uit in vitro getranscribeerd Mrna’s werden voor het eerst gedetecteerd binnen 20 min van electroporation, terwijl FPs van DNA-expressie vectoren werden gedetecteerd pas na 3 h. meervoudige mRNAs-codering voor nucleaire, Golgi en membraan proteïnen kunnen gelijktijdig in een embryo worden geëvacueerd, wat resulteert in een snelle en efficiënte expressie van meervoudige eiwitten in individuele cellen. Ten slotte, met behulp van een in vivo fluorescentie herstel na fotobleaching (FRAP) Assay, tonen we aan dat een meerderheid van de electroporated mRNAs verval binnen 2 h. Dus, snelle initiële eiwitproductie in combinatie met een beperkte nieuwe eiwit vertaling maakt mRNA elektroporation een waardevolle techniek wanneer temporele beheersing van de uitdrukking noodzakelijk is.

Protocol

Alle dier procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de goedgekeurde richtlijnen van het Children’s Hospital Los Angeles en de comités voor institutionele Dierenzorg en-gebruik van de Universiteit van Zuid-Californië. 1. generatie pCS2-gebaseerde expressie vectoren Om pCS2. Lifeact-eGFP te klonen, bereidt u de vector ruggengraat voor door 2 μg pCS2. CycB1-GFP (een constructie met een ander wisselplaat) te verteren met BamHI (10 U) en BsrGI (10 U) in een geschikte…

Representative Results

mRNA-elektroporation is efficiënter dan DNA-elektroporation We gebruikten pCS2 +. H2B-Citrien ter voorbereiding van de in vitro getranscribeerd mRNA. Aangezien DNA-elektroporatie gewoonlijk wordt uitgevoerd bij 1-2 μg/μL, gebruikten we een equimolaire concentratie van mRNA (berekend als ongeveer 0,25-0,5 μg/μL voor H2B-Citrien) voor mRNA-elektroporation. We testten eerst de elektroporation efficiency van pC…

Discussion

In dit protocol hebben we stap voor stap instructies gegeven voor het nauwkeurig microinjecteren en elektroporeren van mRNA in de cellen van gastrulerende kwartel embryo’s. We hebben aangetoond dat in vitro gesynthetiseerde mRNA-elektroporation een snelle en efficiënte expressie van fluorescerende eiwitten (FPs) in gastrulerende kwartel embryo’s (Figuur 2 en 3) mogelijk maakt. Fluorescentie van H2B-Citrien eiwit vertaald uit elektroporated Mrna’s kan worden gedetecteerd doo…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We danken David Huss voor het nuttige inzicht in dit werk. Dit werk werd deels gesteund door de Rose Hills Foundation Summer Research Fellowship (2016-2018) en de undergrad Research Fellowship van USC Provost aan M.T., het Saban Research Institute Intramural training pre-Doctoral Award aan M.D., en de Universiteit van Southern California Undergraduate Research Associates programma Award aan R.L.

Materials

BamHI-HF New England Biolabs R3136L
BglII New England Biolabs R0144S
BsrG1-HF New England Biolabs R3575S
NotI-HF New England Biolabs R3189L
SalI-HF New England Biolabs R3138L
Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol Thermo Fisher 15593031
SP6 mMessage Machine in vitro transcription kit Thermo Fisher AM1340
Fast Green FCF Sigma Aldrich F7252
Triton X-100 Sigma Aldrich 93443 4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol, t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether
DAPI Sigma Aldrich D9542 2-(4-Amidinophenyl)-6-indolecarbamidine dihydrochloride, 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride, DAPI dihydrochloride
Whatman No.1 filter paper Sigma Aldrich WHA1001125
glycerol Sigma Aldrich G9012
Urea Sigma Aldrich 51457
pmTurquoise2-Golgi Addgene 36205 pmTurquoise2-Golgi was a gift from Dorus Gadella (Addgene plasmid # 36205 ; http://n2t.net/addgene:36205 ; RRID:Addgene_36205)
pmEGFP-N1-LifeAct Nat. Methods 2008;5:605-7. PubMed ID: 18536722
pCS2.Lifeact-mGFP Addgene This paper
pCS.H2B-citrine Addgene 53752 pCS-H2B-citrine was a gift from Sean Megason (Addgene plasmid # 53752 ; http://n2t.net/addgene:53752 ; RRID:Addgene_53752)
pCS.memb-mCherry Addgene #53750 pCS-memb-mCherry was a gift from Sean Megason (Addgene plasmid # 53750 ; http://n2t.net/addgene:53750 ; RRID:Addgene_53750)
Zeiss LSM-780 inverted microscope Carl Zeiss Microscopy GmbH The LSM-780 is a confocal and multi-photon microscope that offers the sensitivity required for vital imaging work. Equipped with a motorized stage, an autofocus device, and a full stage-top blackout incubator, the 780 is an excellent microscope for high-end live cell/embryo imaging. The high-sensitivity 32-channel Quasar detector allows for spectral imaging, linear unmixing, and high color count (>4) image acquisition. Excitation can be performed with 6 lines single photon lasers (405, 458, 488, 514, 564 and 633 nm), Chameleon (Coherent) 2-photon laser (range from 690nm to 1000nm), and run with ZEN 2011 SP7 (Black) system software.
CUY-21 EDIT in vivo electroporator Bex Co., Ltd.
Platinum flat square electrode, side length 5 mm Bex Co., Ltd. LF701P5E
Olympus MVX10 FL Stereo Microscope Olympus LifeScience
XM10 Monochrome camera Olympus LifeScience
Phosphate-Buffered Saline (PBS) for HCR (10×, pH 7.4) To prepare 1 L of a 10× stock solution, combine 80 g of NaCl (Sigma-Aldrich S3014), 2 g of KCl (Sigma-Aldrich P9541), 11.4 g of Na2HPO4 (anhydrous; Sigma-Aldrich S3264), and 2.7 g of KH2PO4 (anhydrous; Sigma-Aldrich P9791). Adjust the pH to 7.4 with HCl, and bring the final volume to 1 L with ultrapure H2O. Avoid using CaCl2 and MgCl2 in PBS for HCR. It is important that the PBS for HCR is prepared as an RNase-free solution (e.g., via diethylpyrocarbonate [DEPC] treatment).
1.37 M NaCl
27 mM KCl
80 mM Na2HPO4 20 mM KH2PO4
PBS/Triton Add 1 mL of Triton X-100 (Sigma Aldrich 93443) and 100 mL of 10× PBS to 890 mL of ultrapure distilled H2O. Filter the solution through a 0.2-μm filter and store it at 4 ̊C until use.
1× phosphate-buffered saline (PBS) (DEPC-treated; pH 7.4)
0.1% Triton X-100
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. H. Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields. EMBO Journal. 1 (7), 841-845 (1982).
  2. Potter, H. Electroporation in biology: methods, applications, and instrumentation. Analytical Biochemistry. 174 (2), 361-373 (1988).
  3. Shillito, R. D., Saul, M. W., Paszkowski, J., Muller, M., Potrykus, I. High-Efficiency Direct Gene-Transfer to Plants. Bio-Technology. 3 (12), 1099-1103 (1985).
  4. Cui, C., Rongish, B., Little, C., Lansford, R. Ex Ovo Electroporation of DNA Vectors into Pre-gastrulation Avian Embryos. CSH Protocol. 2007 (24), 4894 (2007).
  5. Voiculescu, O., Papanayotou, C., Stern, C. D. Spatially and temporally controlled electroporation of early chick embryos. Nature Protocol. 3 (3), 419-426 (2008).
  6. Voiculescu, O., Stern, C. D. Manipulating Gene Expression in the Chick Embryo. Methods Molecular Biology. , 105-114 (2017).
  7. Chuai, M., et al. Cell movement during chick primitive streak formation. Developmental Bioliogy. 296 (1), 137-149 (2006).
  8. Krull, C. E. A primer on using in ovo electroporation to analyze gene function. Developmental Dynamics. 229 (3), 433-439 (2004).
  9. Momose, T., et al. Efficient targeting of gene expression in chick embryos by microelectroporation. Developmental, Growth and Differentiation. 41 (3), 335-344 (1999).
  10. Nakamura, H., Watanabe, Y., Funahashi, J. Misexpression of genes in brain vesicles by in ovo electroporation. Developmental, Growth and Differentiation. 42 (3), 199-201 (2000).
  11. Teddy, J. M., Lansford, R., Kulesa, P. M. Four-color, 4-D time-lapse confocal imaging of chick embryos. Biotechniques. 39 (5), 703-710 (2005).
  12. Green, M. R., Maniatis, T., Melton, D. A. Human beta-globin pre-mRNA synthesized in vitro is accurately spliced in Xenopus oocyte nuclei. Cell. 32 (3), 681-694 (1983).
  13. Mimoto, M. S., Christian, J. L. Manipulation of gene function in Xenopus laevis. Methods in Molecular Biology. 770, 55-75 (2011).
  14. Luni, C., et al. High-efficiency cellular reprogramming with microfluidics. Nature Methods. 13 (5), 446-452 (2016).
  15. Bugeon, S., et al. Direct and efficient transfection of mouse neural stem cells and mature neurons by in vivo mRNA electroporation. Development. 144 (21), 3968-3977 (2017).
  16. Riedl, J., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nature Methods. 5 (7), 605-607 (2008).
  17. Turner, D. L., Weintraub, H. Expression of achaete-scute homolog 3 in Xenopus embryos converts ectodermal cells to a neural fate. Genes and Development. 8 (12), 1434-1447 (1994).
  18. Krieg, P. A., Melton, D. A. Functional messenger RNAs are produced by SP6 in vitro transcription of cloned cDNAs. Nucleic Acids Research. 12 (18), 7057-7070 (1984).
  19. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
  20. Eyal-Giladi, H., Kochav, S. From cleavage to primitive streak formation: a complementary normal table and a new look at the first stage of the development of the chick. I. General morphology. Biologie du développement. 49, 321-337 (1976).
  21. Ainsworth, S. J., Stanley, R. L., Evans, D. J. Developmental stages of the Japanese quail. Journal of Anatomy. 216 (1), 3-15 (2010).
  22. Chapman, S. C., Collignon, J., Schoenwolf, G. C., Lumsden, A. Improved method for chick whole-embryo culture using a filter paper carrier. Developmental Dynamics. 220 (3), 284-289 (2001).
  23. Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nature Neurosciences. 14 (11), 1481-1488 (2011).
  24. New, D. A new technique for the cultivation of the chick embryo in vitro. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 3, 320-331 (1955).
  25. Drake, C. J., Davis, L. A., Hungerford, J. E., Little, C. D. Perturbation of beta 1 integrin-mediated adhesions results in altered somite cell shape and behavior. Biologie du développement. 149 (2), 327-338 (1992).
  26. Sato, Y., et al. Dynamic analysis of vascular morphogenesis using transgenic quail embryos. PLoS ONE. 5 (9), e12674 (2010).
  27. Kanda, T., Sullivan, K. F., Wahl, G. M. Histone-GFP fusion protein enables sensitive analysis of chromosome dynamics in living mammalian cells. Current Biology. 8 (7), 377-385 (1998).
  28. Uetrecht, A. C., Bear, J. E. Golgi polarity does not correlate with speed or persistence of freely migrating fibroblasts. European Journal of Cell Biology. 88 (12), 711-717 (2009).
  29. Alberts, B., et al. . Molecular Biology of the Cell. , (2007).
  30. Arndt-Jovin, D. J., Jovin, T. M. Fluorescence labeling and microscopy of DNA. Methods Cell Biol. 30, 417-448 (1989).
  31. Jovin, T. M., Arndt-Jovin, D. J. Luminescence digital imaging microscopy. Annu Rev Biophysics and Biophysical Chemistry. 18, 271-308 (1989).
  32. Heikal, A. A., Hess, S. T., Baird, G. S., Tsien, R. Y., Webb, W. W. Molecular spectroscopy and dynamics of intrinsically fluorescent proteins: coral red (dsRed) and yellow (Citrine). Proceedings of the National Academy of Science U S A. 97 (22), 11996-12001 (2000).
  33. Iizuka, R., Yamagishi-Shirasaki, M., Funatsu, T. Kinetic study of de novo chromophore maturation of fluorescent proteins. Analytical Biochemistry. 414 (2), 173-178 (2011).
  34. Nakamura, H., Katahira, T., Sato, T., Watanabe, Y., Funahashi, J. Gain- and loss-of-function in chick embryos by electroporation. Mechanism of Development. 121 (9), 1137-1143 (2004).
  35. Swartz, M., Eberhart, J., Mastick, G. S., Krull, C. E. Sparking new frontiers: using in vivo electroporation for genetic manipulations. Biologie du développement. 233 (1), 13-21 (2001).
  36. Meyer, S., Temme, C., Wahle, E. Messenger RNA turnover in eukaryotes: pathways and enzymes. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 39 (4), 197-216 (2004).
  37. Bevilacqua, P. C., Ritchey, L. E., Su, Z., Assmann, S. M. Genome-Wide Analysis of RNA Secondary Structure. Annual Review in Genetics. 50, 235-266 (2016).
  38. Harland, R., Misher, L. Stability of RNA in developing Xenopus embryos and identification of a destabilizing sequence in TFIIIA messenger RNA. Development. 102 (4), 837-852 (1988).
  39. Lippincott-Schwartz, J. The long road: peering into live cells. Nature Cell Biology. 12 (10), 918 (2010).
  40. Sato, Y., Lansford, R. Transgenesis and imaging in birds, and available transgenic reporter lines. Development Growth & Differentiation. 55 (4), 406-421 (2013).
  41. Goldman, R. D., Spector, D. L. . Live Cell Imaging: A Laboratory Manual. , (2005).

Tags

MRNA ElectroporationAvian EmbryoProtein ExpressionFluorescent ProteinsTransient TransfectionDevelopmental StageElectroporation ChamberEpiblastVitelline MembraneFluorescent Imaging

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Tran, M., Dave, M., Lansford, R. Fast and Efficient Expression of Multiple Proteins in Avian Embryos Using mRNA Electroporation. J. Vis. Exp. (148), e59664, doi:10.3791/59664 (2019).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image