בדיקת מחוץ גופית מבחן להערכת כלבת חיסון עוצמת
Summary
כאן אנו מתארים בעקיפין כריך מחלה אימונואפלטיוט כדי לקבוע את התוכן החיסוני גליקופרוטאין בחיסון כלבת. מבחן זה משתמש נוגדן מונושבטיים (mAb-D1) לזהות גליקופרוטאין טרימרס. זוהי חלופה למבחן vivo NIH לבצע את העקביות של עוצמת החיסון במהלך הייצור.
Abstract
הדאגה העולמית הגוברת לרווחת בעלי החיים היא לעודד יצרנים ומעבדות השליטה הלאומית (OMCLs) לבצע את האסטרטגיה השלישית להחלפת, צמצום ועידון של בדיקות חיות המעבדה. התפתחות הגישות בתחום החוץ מומלצת ברמות האדם והאירופאי כחלופות למבחן NIH להערכת עוצמת החיסון בכלבת. על פני השטח של וירוס הכלבת (RABV), הטרימרים של גליקופרוטאין מהווים את החיסון העיקרי לגרום לנוגדנים לנטרול נגיפים (VNAbs). מבחן אליסה, שם לנטרל נוגדנים מונובטיים (mAb-D1) להכיר את הצורה הtrimeric של גליקופרוטאין, פותחה כדי לקבוע את התוכן של יליד מקופל trimeric גליקופרוטאין יחד עם הייצור של אצוות החיסון. זה בדיקת מבחנה מבחינה גופית הפגינו קונקורדנציה טובה עם מבחן NIH ונמצא מתאים בניסויים שיתופית על ידי יצרני החיסון RABV ו-OMCLs. הימנעות משימוש בעלי חיים היא מטרה השגה בעתיד הקרוב.
השיטה המוצגת מבוססת על מבוסס על כריך דיאגנוסטיקה בלתי ישירה של אליסה באמצעות mab-D1 אשר מזהה את האתרים העברה אנטיגנית III (aa 330 אל 338) של trimeric rabv גליקופרוטאין, כלומר, אנטיגן מבוסס rabv החיסוני. mAb-D1 משמש לציפוי ולגילוי של טרימרס גליקופרוטאין הנמצאים באצווה החיסון. מאחר והאפירופה מזוהה בשל תכונותיו הקונפורמציה, לא ניתן ללכוד ולזהות את הגליקופרוטאין העלול להיות מזוהה על ידי ה-mAb-D1. החיסון הניתן לבדיקה מודמת בצלחת הנמצאת בתוך לוחית של mAb-D1. Trimeric RABV מאוגד מזוהה על ידי הוספת mAb-D1 שוב, מתויג עם peroxidase ולאחר מכן נחשף בנוכחות מצע כרומוgen. השוואת ספיגת הספיגה נמדדת על החיסון הנבדק וחיסון הייחוס מאפשר לקבוע את התוכן החיסוני של גליקופרוטאין.
Introduction
מאז יותר מ 50 שנים, מבחן NIH1 משמש כשיטה בתקן זהב כדי להעריך את עוצמת החיסון נגד כלבת לפני שחרור האצווה. בדיקה זו מורכבת מחיסון תוך-הצפק של קבוצות של עכברים עם החיסון להיבדק ולאחר מכן האתגר הפנימי (IC) 14 ימים לאחר מכן עם המתח וירוס האתגר תקן (ה-קורות חיים) של וירוס כלבת (RABV). העוצמה מוערכת מתוך שיעור של עכברים ששרדו את האתגר IC. למרות מי2 ו-Pharmacopeia האירופי3 עדיין דורשים מבחן NIH להערכת עוצמת החיסון, בדיקה זו סובלת מכשולים מספר: תוצאות משתנה מאוד4; rabv זיהומיות משמש במהלך האתגר וזה דורש הן מיומנות טכנית ואמצעים אבטחה טיחות קפדנית; מספר גדול של בעלי חיים משמשים, וחומרת האתגר מעלה דאגות אתיות חמורות5. וריאציה חמורה פחות של בדיקה זו פותחה: שבועיים לאחר חיסון פנים הצפק, עכברים לא מאותגרים על ידי IC אבל דימם ונבדק לנוכחות של נוגדנים מסוימים לנטרול ראV (VNAbs) בסרום שלהם באמצעות ניטרול מבחנה. עם זאת, בדיקה זו עדיין דורשת הקרבת מספר רב של עכברי מעבדה למרות שהוא כבר בשימוש עבור חיסונים וטרינריים6,7 ונחשב עבור חיסונים אנושיים8.
החל מעכשיו, הן בינלאומיות9 ו-האירופי10 המלצות לעודד יצרנים ומעבדות השליטה הלאומית (הרפואה הרשמית בקרת מעבדות-omcls) כדי ליישם את ההחלפה, צמצום, ועידון של בדיקות חיות מעבדה, המכונה האסטרטגיה 3rs. הדירקטיבה האירופית 2010/63/האיחוד האירופי (בתוקף מאז 2013/01/01) הקשורים להגנה ולרווחתם של בעלי החיים גם חיזקו את האילוצים ליצרני חיסונים ומעבדות המעורבים בבקרת איכות של חיסונים נגד כלבת, כמו גם במחקר כלבת11. כתוצאה מכך, הפיתוח, האימות והשימוש בחלופות מחוץ לתחום, הפכו כעת לעדיפות. אלה הם לא רק קול מבחינה מוסרית אבל יכול גם להפחית את עלויות בדיקות אצווה לקצר את הזמן עבור תוצאות לשעות במקום שבועות3.
במשטח של החלקיק הרב, מאמצת גליקופרוטאין trimeric טופס12,13,14,15,16. בחיסון נגד כלבת, הטופס יליד trimeric זה מהווה את הגורם החיסוני העיקרי הגורם vnabs17 בעוד monomeric, מסיסים או הדקופרוטייטנטינים הם החיסונית מחמיר18,19. לפיכך, שימור הטרימרים של גליקופרוטאין לאורך תהליך ייצור החיסון הוא אינדיקציה טובה לשימור פוטנציאל חיסוני מיטבי. מספר שיטות חיסוני כימיים, כגון כריכת נוגדן מבחן20,21, החיסוני הרדיאלי היחיד (srd) מבחן22 ואת מבחן אליסה23,24,25,26,27 מומלצים על ידי הסדרה הדו ח הטכני2 ואת מונוגרף האירופי3 לכמת את התוכן אנטיגן חיסונים כלבת. אלה משמשים על ידי היצרנים כדי לפקח על העקביות של ייצור החיסון ועל ידי omcl להעריך את הניסוח עקבית של קבוצות של חיסונים אנושיים28, גם אם בדיקת NIH עדיין נחשב לעוצמה.
עם זאת, כל השיטות הללו של האימונוגלוקליות אינן שוות ערך. מבחן srd דורש טיפול מקדים אשר עשוי לשנות את הטרימרס מעוגן הממברנה ולגרום בצורה מסיסים או מעוגנת של גליקופרוטאין22,29. מכאן, SRD אינו יעיל בהרבה להפלות בין החיסון האנטי-אימונוגלוגניים שאינם חיסוני וכתוצאה מכך הערכה לא מושלמת של החיסוני של מגרש חיסונים. לעומת זאת, מבחן אליסה הוא רגיש יותר22, שומר על מבנה יליד של גליקופרוטאין, והוא מתאים יותר לקבוע את התוכן של הטרימרים המקופלים מקורי של גליקופרוטאין. בדיקת ה-אליסה יכולה להשתמש גם בשני שבטים של הארנב או בעכבר שבטיים אנטי גליקופרוטאין מטוהרים או מרוכזים עם אמוניום גופרתי. מחקרים הפגינו הקונקורדנציה טובה בין בדיקת NIH לבין התוכן אנטיגן העריך על ידי אליסה בחיסונים וסיכם כי שיטות אליסה מתאימים לבדיקת העוצמה מחוץ לגופית. אלה עורכי דין כי בדיקות אליסה עשוי לפחות תוספת או אפילו להחליף את מבחן NIH4,26,27,30,31,32,33. כיום, הפרמקופיאה האירופאית ממליצה על שימוש באסמאולוגי או חיסוני מאומת כחלופות למבחן NIH3. הימנעות מוחלטת של השימוש בעלי חיים לעוצמת החיסון הפך פרספקטיבה ריאליסטית.
השיטה המוצגת להלן מבוססת על כריך מסוג אליסה עקיפה באמצעות שיבוט נוגדן מונובטיים (mab-D1) אשר מזהה את האתרים העברה אנטיגנית III (aa 330 אל 338) של trimeric rabv גליקופרוטאין15,34. שיטה זו פותחה בתחילה ב מכון פסטר26,30 ולאחר מכן ממוטבת ומאומת על ידי סוכנות הידיעות הלאומית דה מדימטיקה של הסוכנות לרפואה ומעבדה, כלומר, omcl הצרפתי4,33. MAb-D1 משמש הן ברגישות לצלחת ולאחר מכן לגילוי האנטיגן שנתפסו. זה מאפשר את הקוונפיקציה ספציפיים של גליקופרוטאין טרימרס, כלומר, האנטיגן החיסוני RABV. MAb-D1 המשמש לאיתור מתויג עם peroxidase, אשר נחשף בנוכחות המצע ו כרומוgen. השוואת ספיגת הספיגה נמדדת על החיסון הנבדק וחיסון הייחוס מאפשר לקבוע את התוכן החיסוני של גליקופרוטאין. יש לציין כי אותו סוג של שיטת ניתן להחיל עבור mAbs שונים לזהות אתרים נוגדי הגניים שונים של RABV גליקופרוטאין35. השיטה כדי להשיג ולטהר או להתרכז עם אמוניום סולפט נגד גליקופרוטאין שבטיים מסוג הארנב (IgG) או globuperoxidase העכבר המונבטיים תיארו בהרחבה בעבר36 יחד עם השיטה המשלים נוגדנים עם37.
Protocol
Representative Results
Discussion
האפיפי המזוהה על ידי mab-D1 ממוקם באתר העברה אנטיגנית III של rabv גליקופרוטאין שהוא לא רק חיסונית-דומיננטי עבור אינדוקציה של vnabs אלא גם מעורב בנוירואלימה, פתוגנונות40,41 וזיהוי הקולטן42. יש עוד אתר חשוב העברה אנטיגנית לאורך גליקופרוטאין, באתר II<sup class="xref"…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ד ר סילבי מורגאטו וד ר ז’אן-מישל צ’סאל חייבים להיות מודעים להשתתפות המפתח שלהם על מנת לבסס את מינון ה-אליסה על אצוות חיסונים ולארגן סדנאות בינלאומיות ומחקרים משותפים. אנחנו מודים לסברינה קאלי. על קריאה קריטית בכתב היד ד ר פייר פרין היה אחראי לבידוד ולאפיון של mAb-D1. עבודה זו נתמכת בעיקר על ידי מימון מכון פסטר.
Materials
| Class II Biological Safety Cabinet | ThermoFisher Scientific | 10445753 | if titrating live virus |
| Clear Flat-Bottom Immuno Nonsterile 96-Well Plates, 400 µL, MAXISORP | ThermoFisher Scientific | 439454 | good for binding to the loaded antibody |
| Equip Labo Polypropylene Laboratory Fume Hood | ThermoFisher Scientific | 12576606 | for the preparation of sulfuric acid |
| Immunology Plate Strong Adsorption MAXISORP Flat Bottom Well F96 |
Dutscher | 55303 | good for binding to the loaded antibody |
| Microplate Sealing Tape(100 sheets) | ThermoFisher Scientific | 15036 | |
| Microplate single mode reader Sunrise | TECAN | ||
| Microplate shaker-incubator | Dutscher | 441504 | |
| Microplate washer Wellwash | ThermoFisher Scientific | 5165000 | |
| Multichannel pipette (30-300 µL) 12 channels | ThermoFisher Scientific | 4661180N | |
| Single Channel pipettes (Kit 2 : Finnpipettes F2 0.2-2 μL micro, 2-20 μL, 20-200 μL & 100-1000 μL) | ThermoFisher Scientific | 4700880 |
References
- Seligmann, E. B. The NIH test for potency. Laboratory Techniques in Rabies. , 279-286 (1973).
- Annex 2. Recommendations for inactivated rabies vaccine for human use produced in cell substrates and embryonated eggs. WHO Technical Report Series. 941, 83-132 (2007).
- . Rabies vaccine for human use prepared in cell cultures. European Pharmacopoeia. , (2008).
- Gibert, R., Alberti, M., Poirier, B., Jallet, C., Tordo, N., Morgeaux, S. A relevant in vitro ELISA test in alternative to the in vivo NIH test for human rabies vaccine batch release. Vaccine. 31, 6022-6029 (2013).
- Stokes, W., et al. Report on the international workshop on alternative methods for human and veterinary rabies vaccine testing: state of the science and planning the way forward. Biologicals. 40 (5), 369-381 (2012).
- Krämer, B., Bruckner, L., Daas, A., Milne, C. Collaborative study for validation of a serological potency assay for rabies vaccine (inactivated) for veterinary use. Pharmeuropa Bio & Scientific Notes. 2, 37-55 (2010).
- Krämer, B., Kamphuis, E., Hanschmann, K. M., Milne, C., Daas, A., Duchow, K. A multi-dose serological assay suitable to quantify the potency of inactivated rabies vaccines for veterinary use. Biologicals. 41, 400-406 (2013).
- Fitzgerald, E. A., Gallagher, M., Hunter, W. S., Seligmann, E. B. Use of the antibody assay in immunized mice for the determination of rabies vaccine potency. Developments in Biological Standardization. 40, 183-186 (1978).
- Milstien, J., Grachev, V., Padilla, A., Griffiths, E., Brown, F., Cussler, K., Hendriksen, C. WHO activities towards the three Rs in the development and control of biological products. Replacement, reduction and refinement of animal experiments in the development and control of biological products. , 31-39 (1996).
- Behr-Gross, M. E., Spieser, J. M. Contributions of the European OMCL Network and Biological Standardisation Programme to animal Welfare. ALTEX-Alternatives to Animal Experimentation. 23, 21-28 (2006).
- . Directive 2010/63/EU of the European Parliament and the Council of 22 September 2010 on the protection of animals used for scientific purposes. Official Journal of European Union. L276, 33-79 (2010).
- Whitt, M. A., Buonocore, L., Prehaud, C., Rose, J. K. Membrane fusion activity, oligomerization and assembly of the rabies virus glycoprotein. Virology. 185 (2), 681-688 (1991).
- Gaudin, Y., Ruigrok, R. W., Tuffereau, C., Knossow, M., Flamand, A. Rabies virus glycoprotein is a trimer. Virology. 187, 627-632 (1992).
- Roche, S., Gaudin, Y. Characterization of the equilibrium between the native and fusion-inactive conformation of rabies virus glycoprotein indicates that the fusion complex is made of several trimers. Virology. 297 (1), 128-135 (2002).
- Desmézières, E., Maillard, A. P., Gaudin, Y., Tordo, N., Perrin, P. Differential stability and fusion activity of Lyssavirus glycoprotein trimers. Virus Research. 91 (2), 181-187 (2003).
- Koraka, P., et al. A recombinant rabies vaccine expressing the trimeric form of the glycoprotein confers enhanced immunogenicity and protection in outbred mice. Vaccine. 32 (36), 4644-4650 (2014).
- Wiktor, T., Gyorgy, E., Schlumberger, D., Sokol, F., Koprowski, H. Antigenic properties of rabies virus components. Journal of Immunology. 110, 269-276 (1973).
- Gamoh, K., Senda, M., Itoh, O., Muramatsu, M., Hirayama, N., Koike, R., et al. Use of ELISA for in vitro potency test of rabies vaccines for animal use. Biologicals. 24, 95-101 (1996).
- Dietzschold, B., Wiktor, T., Wunner, W., Varrichio, A. Chemical and immunological analysis of the rabies soluble glycoprotein. Virology. 124, 330-337 (1983).
- Fitzgerald, E., Green, O., Seligmann, E. Rabies vaccine potency testing: a comparison between the antibody-binding test and the NIH test. Symposia Series in Immunobiological Standard. 21, 300-307 (1974).
- Barth, R., Groβ-Albenhausen, E., Jaeger, O., Milcke, L. The antibody-binding test, a useful method for quantitative determination of inactivated rabies virus antigen. Journal of Biological Standardization. 9, 81-89 (1981).
- Ferguson, M., Schild, G. A single-radial-immunodiffusion technique for the assay of rabies glycoprotein antigen: application for the potency tests of vaccines against rabies. Journal of General Virology. 59, 197-201 (1982).
- Atanasiu, P., Perrin, P., Delagneau, J. F. Use of an enzyme immunoassay with protein A for rabies antigen and antibody determination. Developments in Biological Standardization. 46, 207-215 (1980).
- van der Marel, P., van Wezel, A. Quantitative determination of rabies antigen by ELISA. Developments in Biological Standardization. 50, 267-275 (1981).
- Adamovicz, P., Aguillon, F., David, A., Le Fur, R., Mazert, M. C., Perrin, P., et al. The use of various immunochemical, biochemical and biological methods for the analysis of rabies virus production in tissue cultures. Developments in Biological Standardization. 55, 191-197 (1984).
- Lafon, M., Perrin, P., Versmisse, P., Sureau, P. Use of monoclonal antibody for quantification of rabies vaccine glycoprotein by enzyme immunoassay. Journal of Biological Standardization. 13, 295-301 (1985).
- Thraenhart, O., Ramakrishnan, K. Standardization of an enzyme immunoassay for the in vitro potency assay of inactivated tissue culture rabies vaccines: determination of the rabies virus glycoprotein with polyclonal antisera. Journal of Biological Standardization. 17, 291-309 (1989).
- Council of Europe. . Official Authority Batch release of Rabies vaccines Guideline. , (2019).
- Ferguson, M., Seagroatt, V., Schild, G. A collaborative study on the use of single radial immunodiffusion for the assay of rabies virus glycoprotein. Developments in Biological Standards. 12, 283-294 (1984).
- Perrin, P., Morgeaux, S., Sureau, P. In vitro rabies vaccine potency appraisal by ELISA: advantages of the immunocapture method with a neutralizing anti-glycoprotein monoclonal antibody. Biologicals. 18, 321-330 (1990).
- Rooijakkers, E. J., Uittenbogaard, J. P., Groen, J., Osterhaus, A. D. Rabies vaccine potency control: comparison of ELISA systems for antigenicity testing. Journal of Virological Methods. 58, 111-119 (1996).
- Rooijakkers, E. J., Uittenbogaard, J. P., Groen, J., van Herwijnen, J., Osterhaus, A. D., Brown, F., Cussler, K., Hendriksen, C. . Development and evaluation of alternative testing methods for the in vivo NIH potency test used for the quality control of inactivated rabies vaccines. , 137-145 (1996).
- Fournier-Caruana, J., et al. Inactivated rabies vaccine control and release: use of an ELISA method. Biologicals. 31, 9-16 (2003).
- Sissoëff, L., Mousli, M., England, P., Tuffereau, C. Stable trimerization of recombinant rabies virus glycoprotein ectodomain is required for interaction with the p75NTR receptor. Journal of General Virology. 86, 2543-2552 (2005).
- Morgeaux, S., et al. Replacement of in vivo human rabies vaccine potency testing by in vitro glycoprotein quantification using ELISA – Results of an international collaborative study. Vaccine. 35 (6), 966-971 (2017).
- Lafon, M., Meslin, F. X., Kaplan, M. N., Kopowski, H. Techniques for the production, screening and characterisation of monoclonal antibodies. Laboratory techniques in rabies, 4th Edition. , 133-144 (1996).
- Perrin, P., Meslin, F. X., Kaplan, M. N., Kopowski, H. Techniques for the preparation of rabies confugates. Laboratory techniques in rabies, 4th Edition. , 433-444 (1996).
- Barth, R., Diderrich, G., Weinmann, E. NIH test, a problematic method for testing potency of inactivated rabies vaccine. Vaccine. 6, 369-377 (1988).
- Jallet, C., et al. Chimeric lyssavirus glycoproteins with increased immunological potential. Journal of Virology. 73, 225-233 (1999).
- Dietzschold, B., et al. Characterization of an antigenic determinant of the glycoprotein that correlates with pathogenicity of rabies virus. Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 80, 70-74 (1983).
- Seif, L., Coulon, P., Rollin, P., Flamand, A. Rabies virulence: effect on pathogenicity and sequence characterization of rabies virus mutations affecting antigenic site III of the glycoprotein. Journal of Virology. 53, 926-934 (1985).
- Lafon, M. Rabies virus receptors. Journal of Neurovirology. 11, 82-87 (2005).
- Benmansour, A., Leblois, H., Coulon, P., Tuffereau, C., Gaudin, Y., Flamand, Y., Lafay, A. Antigenicity of the rabies virus glycoprotein. Journal of Virology. 65, 4198-4203 (1991).
- . . Rabies Vaccine Workshop Summary. , (2011).
- De Mattia, F., et al. The Vaccines Consistency Approach Project: an EPAA initiative. Pharmeuropa Bio & Scientific Notes. 2015, 30-56 (2015).
