Sequentie ruimte verkennen om bindende sites te identificeren voor regulatoire RNA-bindende eiwitten

In celbiologie speelt genregulatie een centrale rol. Bij een of meerdere stappen langs het genexpressie traject hebben genen het potentieel om gereguleerd te worden. Deze stappen omvatten transcriptie (initiatie, rek en beëindiging), evenals splicing, polyadenylering of 3 ‘ end Formation, RNA export, mRNA vertaling, en verval/lokalisatie van primaire transcripten. Op deze stappen moduleren nucleïnezuur-bindende eiwitten genregulatie. Identificatie van bindende plaatsen voor dergelijke eiwitten is een belangrijk aspect van het bestuderen van gencontrole. De vergelijking van mutational analyse en fylogenetische sequentie is gebruikt om regelgevings sequenties of eiwit bindende locaties in nucleïnezuren te ontdekken, zoals promotors, Splice sites, polyadenylatie elementen en translationele signalen^{1, 2 , 3 , 4}.

Pre-mRNA splicing is een integrale stap tijdens genexpressie en regulatie. Het merendeel van de zoogdier genen, ook bij mensen, heeft introns. Een groot deel van deze Transcripten is ook gesplitst, waardoor meerdere mRNA-en proteïne-isovormen uit hetzelfde gen of primaire transcript worden geproduceerd. Deze isovormen hebben celspecifieke en ontwikkelings rollen in de celbiologie. De 5 ‘ splice site, de tak-Point, en de polypyrimidine-Tract/3 ‘ splice site zijn kritische splicing signalen die onderworpen zijn aan regulering. In negatieve regulatie wordt een anderszins sterke Splice site onderdrukt, terwijl in positieve regulatie een anderszins zwakke Splice site wordt geactiveerd. Een combinatie van deze gebeurtenissen produceert een overvloed aan functioneel verschillende isoforms. RNA-bindende eiwitten spelen belangrijke rollen in deze alternatieve splicing-gebeurtenissen.

Er zijn talrijke eiwitten bekend waarvan de bindende plaats (en) of RNA-doelen nog steeds worden geïdentificeerd op^5,6. Het koppelen van regelgevende eiwitten aan hun downstream biologische doelen of sequenties is vaak een complex proces. Voor dergelijke eiwitten is identificatie van hun doel RNA of bindingsplaats een belangrijke stap in het bepalen van hun biologische functies. Zodra een binding site is geïdentificeerd, kan deze verder worden gekarakteriseerd met behulp van standaard moleculaire en biochemische analyses.

De hier beschreven aanpak heeft twee voordelen. Ten eerste kan het een eerder onbekende binding site identificeren voor een eiwit van belang. Ten tweede, een bijkomend voordeel van deze aanpak is dat het tegelijkertijd verzadiging mutagenese toestaat, die anders arbeidsintensief zou zijn om vergelijkbare informatie te verkrijgen over de sequentie vereisten binnen de binding site. Zo biedt het een sneller, gemakkelijker en minder kostbaar hulpmiddel om eiwit bindende sites in RNA te identificeren. Oorspronkelijk werd deze aanpak (Selex of systematische evolutie van liganden door exponentiële verrijking) gebruikt om de bindingsplaats te karakteriseren voor de bacteriofaag T4 DNA polymerase (Gene 43 Protein), die overlapt met de ribosoom binding site in zijn eigen mRNA. De binding site bevat een 8-base lus reeks, die 65.536 gerandomiseerde varianten voor analyse⁷vertegenwoordigt. Ten tweede werd de benadering ook onafhankelijk gebruikt om aan te tonen dat specifieke bindingsplaatsen of aptamers voor verschillende kleurstoffen kunnen worden geselecteerd uit een pool van ongeveer 10¹³ sequenties⁸. In feite is deze aanpak in veel verschillende contexten algemeen gebruikt om aptamers (RNA-of DNA-sequenties) te identificeren voor het binden van talrijke liganden, zoals eiwitten, kleine moleculen en cellen, en voor katalyse⁹. Als voorbeeld kan een aptamer discrimineren tussen twee xanthinederivaten, cafeïne en theofylline, die verschillen door de aanwezigheid van één methylgroep in cafeïne¹⁰. We hebben deze aanpak uitgebreid gebruikt (SELEX of iteratieve selectie-amplificatie) om te bestuderen hoe RNA-bindende eiwitten functioneren in splicing of splicing Regulation¹¹, die de basis zal zijn voor de discussie hieronder.

De Random Library: we gebruikten een willekeurige bibliotheek van 31 nucleotiden. De lengte overweging voor de Random Library was losjes gebaseerd op het idee dat de algemene splicing factor U2AF⁶⁵ bindt aan een sequentie tussen de vertakkingspunt sequentie en de 3 ‘ splice site. Gemiddeld is de afstand tussen deze splicing signalen in figuur in het bereik van 20 tot 40 nucleotiden. Een ander eiwit geslacht-dodelijk was bekend om te binden aan een slecht gekarakteriseerde regelgevings sequentie in de buurt van de 3 ‘ splice site van zijn doelwit Pre-mRNA, transformator. Zo kozen we voor een willekeurige regio van 31 nucleotiden, geflankeerd door primer bindingsplaatsen met restrictie-enzym locaties om PCR-versterking en bevestiging van de T7 RNA polymerase Promoter voor in vitro transcriptie mogelijk te maken. De theoretische bibliotheek grootte of complexiteit bedroeg 4³¹ of ongeveer 10¹⁸. We gebruikten een kleine fractie van deze bibliotheek om onze willekeurige RNA-pool voor te bereiden (~ 10¹²-10¹⁵) voor de hieronder beschreven experimenten.