La méthode présentée ici utilise le micromodèle avec l’imagerie quantitative pour révéler l’organisation spatiale au sein des cultures mammifères. La technique est facile à établir dans un laboratoire standard de biologie cellulaire et offre un système tractable pour étudier le modelage in vitro.
Un objectif fondamental en biologie est de comprendre comment les modèles émergent au cours du développement. Plusieurs groupes ont montré que le modelage peut être réalisé in vitro lorsque les cellules souches sont confinées spatialement sur des micromodèles, mettant ainsi en place des modèles expérimentaux qui offrent des possibilités uniques d’identifier, in vitro, les principes fondamentaux de la biologie organisation.
Ici, nous décrivons notre propre mise en œuvre de la méthodologie. Nous avons adapté une technique de photo-modèle pour réduire le besoin d’équipement spécialisé pour faciliter l’établissement de la méthode dans un laboratoire standard de biologie cellulaire. Nous avons également développé un cadre d’analyse d’image gratuit, open-source et facile à installer afin de mesurer précisément le positionnement préférentiel des sous-populations de cellules dans des colonies de formes et de tailles standard. Cette méthode permet de révéler l’existence d’événements de modelage même dans des populations apparemment désorganisées de cellules. La technique fournit des informations quantitatives et peut être utilisée pour découpler les influences de l’environnement (p. ex., indices physiques ou signalisation endogène), sur un processus de modelage donné.
Dans les systèmes mammifères, le modelage est une propriété émergente du comportement collectif des cellules et ainsi, les modèles peuvent se former in vitro si des indices appropriés sont fournis aux cellules1,2,3,4, 5 Annonces , 6. Une façon de révéler la capacité intrinsèque des cellules à s’auto-organiser in vitro est de forcer les cellules à former des groupes/colonies d’une forme et d’une taille définies7,8,9,10 . Une technique qui permet cela est micropatterning11. Le micro-patterning permet de définir avec précision l’emplacement où les molécules de matrice extracellulaire (ECM) sont déposées sur une surface. Ceci, à son tour dicte où les cellules peuvent adhérer et contrôle donc la façon dont les cellules s’organisent spatialement.
Le micropatterning est une technique avec de nombreuses applications, par exemple, le micropatterning permet la normalisation des conditions initiales avant la différenciation12. Fait important, le micro-modèle permet de contrôler facilement la taille, la forme et l’espacement des colonies cellulaires et cette propriété peut être utilisée pour concevoir des expériences visant à interroger la réponse collective des cellules à la morphogène ou aux indices physiques7 , 8 Annonces , 10 Ans et plus , 13 (en) , 14 (en) , 15 Annonces , 16 Annonces , 17.
Plusieurs méthodes de micro-patterning ont été développées11. Les techniques de photopatterning sont peut-être les méthodes les plus faciles à établir18. Ces approches ont également l’avantage de la précision car elles peuvent être utilisées pour contrôler la forme des cellules simples18,19,20. Cependant, ils ont également besoin d’équipement spécialisé coûteux, y compris un spin coater, une chambre à plasma et un UVO (UV-Ozone) nettoyant qui ne sont généralement pas facilement disponibles dans les laboratoires de biologie standard. Pour faciliter l’adoption de la technique, nous avons adapté le protocole pour ne nécessiter que la lampe UVO. Nous commençons à partir de diapositives en plastique disponibles dans le commerce qui peuvent être coupés avec des ciseaux ou avec un poinçon de trou au format désiré.
Une utilité importante des micromodèles est la capacité de normaliser les colonies afin de comparer les colonies individuelles à travers de multiples répliques. Cela permet de se demander dans quelle mesure la formation des motifs au sein de ces colonies est reproductible, et d’explorer les facteurs qui influencent la robustesse du processus de modelage. Fait important, la quantification des modèles « moyens » dans plusieurs colonies normalisées peut également révéler des processus de modelage qui ne seraient pas apparents autrement. L’avantage de pouvoir quantifier le modelage sur des colonies normalisées dépend de la mesure de mesurer avec précision l’expression des protéines, idéalement au niveau des cellules uniques. Cependant, les cellules sur les micromodèles sont souvent serrées, ce qui les rend difficiles à segmenter avec une grande précision. Les cellules s’organisent souvent en trois dimensions plutôt qu’en deux dimensions, et il peut être difficile de détecter et de préserver l’information tridimensionnelle (3D) pendant la segmentation. Une fois que les cellules ont été segmentées avec succès, des méthodes de calcul sont nécessaires pour extraire l’information de modèle des ensembles de données résultants.
Nous avons développé des outils de segmentation et d’analyse d’images pour aider à surmonter ces problèmes. Cette méthode d’analyse n’utilise que des logiciels libres et open-source et ne nécessite pas de connaissance de la ligne de commande ou de la programmation pour la mise en œuvre. Pour illustrer la méthode ici, nous utilisons des cellules de tige embryonnaire de souris (MES) qui expriment spontanément un marqueur de brachyury de différenciation tôt (Tbra)21,22. Bien qu’aucun arrangement spatial apparent ne soit visuellement détectable, la méthode permet la création d’une carte du positionnement préférentiel des cellules Tdans les colonies. Nous montrons également que le modelage de Tbra contraste avec l’absence d’une localisation préférentielle des cellules exprimant Id1, une lecture directe de la protéine morphogénétique osseuse (BMP) voie23. Nous discutons également des limites actuelles de la méthode et de la façon dont cette technique peut être adaptée à d’autres systèmes expérimentaux.
Ici nous décrivons une méthode pour analyser le modelage émergent dans les cultures des cellules. Une approche simplifiée de micropatterning est utilisée pour normaliser la forme et la taille des colonies cellulaires, et nous présentons des outils d’analyse d’image et des scripts R qui permettent la détection et la quantification des modèles au sein de ces colonies.
Le pipeline que nous proposons est similaire dans une certaine mesure avec une méthode31 publiée précédemment où les auteurs se concentrent sur les conditions de culture, en utilisant des micromodèles disponibles dans le commerce, pour obtenir la formation reproductible de couche germinale dans les colonies esC pour le l’étude des événements précoces de gastrulation in vitro. Notre objectif est plus axé sur la fourniture d’un pipeline généralisable pour la découverte de la formation de modèles in vitro où l’organisation collective des cellules ne peut devenir apparente qu’après analyse statistique. Pour cette raison, nous fournissons un workflow d’analyse d’image robuste qui permet l’identification et l’analyse précises de la position nucléaire dans l’espace 3D sur plusieurs colonies (voir aussi la section « Avantage et limitations de la méthode de détection des motifs » de cette discussion). Nous avons également décidé de développer une approche simple de micropatterning interne qui offre une alternative plus flexible et moins chère aux solutions disponibles dans le commerce à long terme qui, nous l’espérons, seront utiles à la communauté.
Enfin, nous notons que lors de la révision de ce manuscrit, un nouveau paquet pour l’analyse des motifs in vitro similaire à nos scripts R a été publié32. Ce nouveau paquet accepte les tables de caractéristiques cellulaires comme entrée qui peuvent être obtenues à partir de plates-formes d’imagerie à haut débit. Nous croyons que la table des caractéristiques des noyaux générées à l’étape 7 de notre protocole pourrait en principe servir d’entrée à ce nouveau paquet, bien que nous n’ayons pas testé cette possibilité nous-mêmes.
Adaptabilité de la méthode à d’autres types de cellules et géométries de colonies
Nous présentons cette approche dans le contexte d’étudier l’émergence des facteurs de transcription mésodermales dans les cultures des cellules pluripotentes en présence du sérum. Cependant, la méthode est facilement adaptable à d’autres types de cellules et aux cultures sans sérum, bien qu’il puisse être nécessaire d’optimiser les concentrations d’ECM/poloxamer 407 (voir le tableau 1 pour les concentrations testées et le tableau 2 pour un guide de dépannage). La méthode peut également être adaptée à des tailles plus ou moins grandes de micromodèles et à un large éventail de formes en fonction des besoins de l’utilisateur. Cependant, tout en établissant la méthode, il est important d’être conscient que toutes les combinaisons de forme /type cellulaire ne sont pas optimales. Par exemple, le MESC exprime des niveaux élevés d’E-cadherin33,34 permettant à ces cellules de former des structures collectives couvrant des zones dépourvues d’ECM. Ces cellules ne suivent pas strictement les géométries avec des angles pointus ou qui incluent de petits trous dans le modèle. Notez par exemple que sur l’anneau de la figure 3B, les cellules sont en train de coloniser la zone centrale. Dans nos mains, une zone centrale plus petite n’a pas forcé le MESC à former des colonies en forme d’anneau. Il est donc fortement recommandé d’inclure une diversité de géométries lors de la conception du photomask pour être en mesure de tester et d’identifier les tailles optimales et les courbures qui seront adaptés pour le type de cellule de choix.
Un autre facteur important à prendre en considération est la durée de l’expérience et le taux de prolifération des cellules. Pour certains types de cellules qui prolifèrent rapidement (y compris les cellules pluripotentes), il peut être difficile de maintenir les cellules sur des micromodèles sur plusieurs jours (Pour mESC trois jours est un maximum). En outre, l’ensemencement des cellules sur les micromodèles ne se produit pas toujours de manière optimale pour chaque colonie, il est donc conseillé de semer un excès de colonies afin d’avoir des pièces de rechange.
Avantage et limitations de la méthode de détection des modèles
Un avantage particulier de la méthode est la capacité de détecter les modèles « moyens » en combinant les résultats de l’analyse d’image provenant de colonies de repli multiples (figure 5). Cela peut révéler des événements de modelage qui ne sont pas apparents de l’inspection des colonies individuelles. Un inconvénient de cette approche de « moyenne » est qu’elle peut manquer certains types de modèles répétitifs, par exemple de petites taches ou des bandes étroites. Cependant, ces types de modèle peuvent plutôt être révélés avec une combinaison de tailles de modèle soigneusement choisies8. De plus, le pipeline d’analyse d’images décrit ici fournit des données quantitatives à la fois à une seule cellule et à la résolution de la colonie, offrant la possibilité d’étudier le niveau de variabilité intercoloniale (figure 5) ou d’effectuer l’analyse des voisins à plusieurs échelles10.
Un autre avantage important de la méthode de la moyenne est qu’elle offre la possibilité de cartographier l’emplacement préférentiel de nombreux marqueurs sans être limité par les fluorophores disponibles des canaux de détection. En effet, bien que nous n’utilisions que deux marqueurs de différenciation dans les travaux présentés ici, la capacité de normaliser les colonies et d’extraire des modèles « moyens » permet de comparer les cartes de distribution de différents ensembles de colonies afin de pour révéler les relations spatiales généralisées des marqueurs les uns aux autres.
En outre, bien que notre objectif ici ait été d’étudier des marqueurs de différenciation, la méthode d’analyse peut être étendue pour étudier d’autres processus biologiques pour lesquels des marqueurs nucléaires sont disponibles. Par exemple, le micromodelage d’une lignée cellulaire contenant un indicateur de cycle cellulaire d’ubiquitination de fluorescence35 (FUCCI) permettrait d’étudier comment la géométrie du niveau des colonies peut influencer les événements du cycle cellulaire dans le groupe.
Orientations futures
La méthode est favorable à l’analyse d’image de débit moyen, cependant, l’acquisition d’image n’est actuellement pas entièrement automatisée et peut devenir limitante pour les expériences très grandes. Les arrangements réguliers des colonies devraient permettre de créer des routines d’acquisition entièrement automatisées semblables à ce qui a été développé pour une cellule unique en moyenne20. Cependant, parce que la taille du champ nécessaire pour l’image d’une colonie est grande, nécessitant peut-être mosaïque, et parce que les colonies sont tridimensionnelles, il est hautement souhaitable de réduire à la fois la taille des ensembles de données et le temps d’acquisition par l’imagerie que les colonies pertinentes. Par conséquent, des efforts futurs pourraient être consacrés à la mise au point d’un microscope « intelligent » capable d’identifier les colonies pertinentes et d’adapter les coordonnées d’imagerie à chaque échantillon. Cela permettra non seulement de réduire le temps et les efforts, mais aussi d’éviter les biais potentiels de l’opérateur.
Les pipelines d’analyse peuvent également être rendus plus efficaces en réduisant le nombre de mesures que l’utilisateur doit prendre. Nous avons l’intention de construire un mécanisme de construction de pipelines et d’intégrer R directement dans notre logiciel (voir aussi les questions pickcells-api-3 et pickcells-rjava-1 dans le tracker d’émission de nos référentiels de code [https://framagit.org/groups/pickcellslab/-/issues]). L’automatisation complète de la procédure d’analyse réduira le temps et l’effort et limitera les erreurs potentielles de l’utilisateur.
Enfin, nous notons que notre méthode d’analyse ne saisit pas encore pleinement la nature dynamique du modelage cellulaire. Certaines informations dynamiques limitées peuvent être extraites en examinant une série chronologique d’images instantanées8,10,36. Cependant, être en mesure d’enregistrer l’histoire de la population cellulaire est hautement souhaitable si nous voulons mieux comprendre comment le modèle émerge. Une limitation est que le suivi précis des cellules individuelles dans une population de cellules denses 3D reste une tâche très difficile37. Notre méthode de détection cellulaire utilise l’enveloppe nucléaire et fonctionne particulièrement bien sur les populations cellulaires denses et qui se chevauchent28. Les journalistes en direct de l’enveloppe nucléaire sont facilement disponibles28,38 et un avantage de la technique de micro-patterning est qu’il peut être utilisé pour empêcher les cellules de se déplacer en dehors du champ de vision pendant l’imagerie à long terme. Dans l’ensemble, nous sommes convaincus que le suivi automatisé des cellules sera réalisable à l’aide d’une combinaison d’outils récemment mis en place28,39,40 et que cela devrait apporter de nouvelles idées dans le fondamental principes d’auto-organisation.
The authors have nothing to disclose.
Ce travail a été financé par une bourse postdoctorale Sir Henry Wellcome (WT100133 à G.B.), une bourse d’études supérieures Wellcome Trust (WT103789AIa à S.L.), et un doctorat de Wellcome Trust à (108906/Z/15/Z à D.W.). Nous sommes également reconnaissants au Dr Manuel Thery pour ses conseils sur l’adaptation de la technique de photopatterning.
2-mercaptoethanol | Gibco | 31350-010 | handle in fume hood |
1× Master quartz anti-reflective chromium photomask | Toppan Photomask | Custom design | |
24-well plates | Corning | 3526 | |
4-well plates | Nunclon Delta | 176740 | |
5% Donkey Serum | Sigma | D9663 | |
Anti Nuclear pore complex | Abcam | ab24609 | Mouse monoclonal, use 1:1000 |
Anti-Id1 | Biocheck | 37-2 | Rabbit polyclonal, use 1:200 |
Anti-Lamin B1 | Abcam | ab16048 | Rabbit polyclonal, use 1:1000 |
Anti-Tbra | R&D | AF2085 | Goat ployclonal, use 1:400 |
Blocking Solution | NA | NA | 0.1% TritonX-100 0.01% Pluronic F-127 5% Donkey Serum 0.003% Sodium Azide In PBS |
CGR8 mESC | NA | NA | Reference: Mountford et al. PNAS, 1994 |
Fixation solution | NA | NA | 4% PFA diluted in washing solution |
Foetal bovine serum | Gibco | 10270-106 | Serum batches must be tested to ensure compatibility with ESC maintenance |
Gelatin | Sigma | G1890 | |
Glasgow Minimum Essential Medium | Sigma | G5154 | |
Laboratory Film | VWR | 291-1212 | |
Layout Editor Software | LayoutEditor | NA | https://layouteditor.com/ |
Layout Editor Software | Klayout | NA | https://www.klayout.de/ |
L-glutamine | Gibco | 25030-024 | |
LIF | Millipore | ESG1107 | |
MEM NEAA | Gibco | 11140-035 | |
mESC Culture medium | NA | NA | GMEM 10% FCS 100 U/ml LIF 100 nM 2-mercaptoethanol 1× non-essential amino acids, 2 mM L- glutamine 1 mM sodium pyruvate |
NH4Cl 50mM | Sigma | 9718 | |
Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | CAUTION: Toxic, handle undiluted stocks in fume hood and wear protective equipment |
PBS (immunostaining) | Sigma | P4417 | Dilute in 200ml of ddH2O |
PBS (tissue culture) | Gibco | 11140-035 | |
Plastic slides | Ibidi | IB-10813 | |
Poloxamer 407 | Sigma | P2443 | |
ProLong Gold Antifade Mountant | Molecular Probes | P36930 | |
Sodium Azide | Sigma | 8591 | CAUTION: Toxic, handle in fume hood and wear protective equipment |
Sodium pyruvate | Gibco | 11360070 | |
TritonX-100 | Sigma | T8532 | |
Trypsin | Gibco | 25200056 | |
UVO cleaner | Jetlight, USA | 42-220 | CAUTION: Follow manufacturer’s safety recommendations |
Washing Solution | NA | NA | 0.1% TritonX-100 0.01% Pluronic F-127 In PBS |