시험관 내 전사 된 RNA-기반 루시퍼 라 제 리포터 검정은 폭스 바이러스 감염 세포에서 번역 조절을 연구 하기 위해
Summary
우리는 시험관 내 전사 된 RNA 기반 루시퍼 라 제 리포터 분석을 사용 하 여 폭스 바이러스에 감염 된 세포에서 mRNA 번역 조절을 연구 하기 위한 프로토콜을 제시 합니다. 분석 법은 5 ‘-미 번역 지역 (UTR) 및 3 ‘-UTR를 포함 하 여 mRNA의 cis요소에 의해 번역 조절을 연구 하기 위하여 이용 될 수 있습니다. 이 방법을 사용 하 여 다른 변환 시작 모드를 검사할 수도 있습니다.
Abstract
바이러스 DNA 복제 후에 전사 된 모든 폭스 바이러스 mRNA는 5 ‘-UTR의 진화 적으로 보존 된 비 템플릿 기반 5 ‘ 폴 리 (A) 선두 주자입니다. 폭스 바이러스 감염 시 mRNA 번역에서 5 ‘-폴 리 (A) 지도자의 역할을 해 하는 우리는 시험관 내 전사 된 RNA 기반 루시퍼 라 제 리포터 검정을 개발 했습니다. 이 리포터 검정은 4 개의 핵심 단계를 포함 한다: (1) 시험관 내 전사를 위한 DNA 템플릿을 증폭 하는 PCR; (2) 시험관 내 전사 T7 RNA 중 합 효소를 사용 하 여 mRNA를 생성 하는 단계; (3) 시험관 내에서 세포 내로 전사 된 mRNA를 도입 하는 형질 전환; (4) 번역의 지표로 서의 루시퍼 라 제 활동의 검출. 여기에 설명 된 RNA 기반 루시퍼 라 제 리포터 분석은 플라스 미드 로부터 폭스 바이러스에 감염 된 세포 및 비밀 전사의 플라스 미드 복제의 문제를 회피 한다. 이 프로토콜은 폭스 바이러스에 감염 된 세포가 아닌 시스템에서 5 ‘-UTR 및 3 ‘-UTR를 포함 한 mRNA의 cis원소에의 한 번역 조절을 결정 하는데 사용 될 수 있다. 또한이 방법을 사용 하 여 cap 종속, cap 독립적, 다시 시작 및 내부 시작과 같은 다양 한 번역 시작 모드를 조사할 수 있습니다.
Introduction
중앙 교리에 따르면, 유전 정보는 DNA에서 RNA로 그리고 마침내 단백질1,2로 흐릅니다. 유전 정보의이 흐름은 mRNA 번역3을포함 하 여 많은 수준에서 높게 통제 됩니다,4. 유전자 발현 조절을 측정 하기 위한 리포터 분석의 개발은이 과정에 관여 하는 규제 메커니즘의 이해를 용이 하 게 한다. 여기서 우리는 폭스 바이러스에 감염 된 세포에서 시험관 내 전사 된 RNA 기반 루시퍼 라 제 리포터 분석 법을 사용 하 여 mRNA 번역을 연구 하는 프로토콜을 설명 한다.
폭스 바이러스는 많은 매우 위험한 인간과 동물 병원 균을 포함 한다5. 다른 모든 바이러스 처럼, 폭스 바이러스 독점적으로 단백질 합성에 대 한 호스트 세포 기계에 의존6,7,8. 바이러스 성 단백질을 효율적으로 합성 하기 위해 바이러스는 세포 중개 기계를 납치 하 여 바이러스 mrnas7,8의 번역을 위해이를 리디렉션하는 많은 전략을 진화 시켰습니다. 바이러스에 의해 일반적으로 채택 되는 기계 장치는 그들의 전사체에 있는 cis행동 요소를 사용 하는 것입니다. 주목할 만한 예로는 내부 리보솜 진입 부위 (에 어) 및 캡 독립적인 번역 증강 인자 (인용),11등이 있다. 이러한 cis요소는 다양 한 기 작12,13,14를 통해 중개 기계를 유치 함으로써 번역 적 우위를 바이러스 전사체를 렌더링 한다. 100 폭스 바이러스 mrnas는 5 ‘ 미 번역 지역 (UTR)에서 진화 하 여 보존 된 시스-작동 소자를가지고 있으며,이러한 mrnas15의 5 ‘ 말단에서 5 ‘ 폴 리 (a) 리더입니다. 이러한 5 ‘-폴 리 (A) 지도자의 길이는 이종 이며 전사 동안 폭스 바이러스 부호화 RNA 중 합 효소17,18의 미 끄 러 짐에 의해 생성 된다. 우리와 다른 사람들은 최근 5 ‘-폴 리 (A) 지도자가 백 시 니 아 바이러스 (vacv)에 감염 된 세포에서 mRNA에 번역 이점을 부여 한다는 것을 발견 하였으며,이는 폭스 바이러스19,20의 프로토 타입 부재 이다.
시험관 내 전사 된 RNA 계 루시퍼 라 제 리포터 분석은 처음에 폭스 바이러스 감염19,21동안 mRNA 번역에서 5 ‘-폴 리 (A) 지도자의 역할을 이해 하기 위하여 개발 되었다. 플라스 미드 DNA 기반 루시퍼 라 제 리포터 분석 법이 널리 사용 되 고 있지만, 폭스 바이러스 감염 세포에서의 결과 해석을 복잡 하 게 하는 몇 가지 단점이 있다. 먼저, 플라스 미드는 VACV 감염 세포 (22)에서 복제할 수 있다. 둘째, 암호화 된 전사는 플라스 미드 DNA18,23,24에서 종종 발생 한다. 셋째, VACV 프로모터 구동 전사는 불균일 한 길이의 폴 리 (A) 리더를 생성 하 여 일부 실험18에서 폴 리 (a) 지시선 길이를 제어 하기 어렵게 한다. 시험관 내 전사 된 RNA 기반 루시퍼 라 제 리포터 분석은 이러한 문제를 회피 하 고 데이터 해석은 간단 합니다.
이 방법에는 4 가지 주요 단계가 있습니다. (1) 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR)은 시험관 내 전사를 위한 DNA 템플릿을 생성 하는 단계; (2) 시험관 내 전사 mRNA를 생성 하는 단계; (3) 세포에 mRNA를 전달 하는 형질 전환; (4) 번역의 지표로 서의 루시퍼 라 제 활동의 검출 (그림 1) 얻어진 PCR 증폭은 5 ‘ ~ 3 ‘ 방향으로 다음과 같은 요소를 포함 합니다: T7, 폴 리 (a) 리더 또는 원하는 5 ‘ UTR 서 열, 반딧불 루시퍼 라 제 오픈 리딩 프레임 (ORF) 뒤에 폴 리 (a) 꼬리. PCR 증폭은 T7 중 합 효소를 사용 하 여 시험관 내 전사에 의해 mRNA를 합성 하는 템플릿으로 사용 된다. 시험관 내 전사 동안, m7G 캡 또는 다른 캡 아날로그는 새로 합성 된 mRNA에 혼 입 된다. 캡 핑 된 전사체는 감염 되지 않은 또는 VACV 감염 된 세포로 형질 전환 된다. 세포 파쇄 액은 형질 감염 후 원하는 시간에 수집 되어 mRNA 로부터 단백질 생산을 나타내는 루시퍼 라 제 활동을 측정 한다. 이 리포터 분석 법은 mRNA의 5 ‘-UTR, 3 ‘-UTR 또는 그밖 지구에 있는 cis원소 존재에 의해 번역 규칙을 공부 하기 위하여 이용 될 수 있습니다. 더욱이, 시험관 내 전사 된 RNA-기반 어 세이는 캡 의존적 개시, 캡 독립적 개시, 재 개시 및 아 스와 같은 내부 개시를 포함 하는 번역 개시의 상이한 메커니즘을 연구 하는데 사용 될 수 있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
모든 4-코어 단계는 시험관 내 전사 된 RNA 기반 루시퍼 라 제 리포터 분석의 성공에 매우 중요 합니다. 특히 T7 프로모터 서 열에 대 한 프라이 머 디자인에 특별 한 주의가 주어져야 한다. T7 RNA 중 합 효소는 T7 프로모터의 밑줄이 그어진 첫 번째 G (gGG-5′-UTR) 로부터 전사를 시작 하 여 5 ‘ UTR 서 열 전에 첨가 하였다. 전사 개시 사이트 (TSS)는 5 ‘ 말단에서 제 1 G 로부터 시작 하지만, T7 프로모터 영?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 프로젝트는 지 부 및 존슨 암 연구 센터 (http://cancer.k-state.edu)에 의해 부분적으로 PD에 대학원 학생 여름 급여의 형태로 건강의 국립 연구소 (AI128406 www.nih.gov)에 의해 투자 되었다.
Materials
| 2X-Q5 Master mix | New England Biolabs | M0492 | High-Fidelity DNA Polymerase used in PCR |
| 3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')G RNA Cap Structure Analog | New England Biolabs | S1411L | Anti reverse Cap analog or ARCA |
| Corning 96 Well Half-Area white flat bottom polystyrene microplate | Corning | 3693 | Opaque walled 96 well white plate with solid bottom |
| Dual-Luciferase Reporter Assay System | Promega | E1960 | Dual-Luciferase Assay Kit (DLAK) |
| E.Z.N.A. Cycle Pure Kit | OMEGA BIO-TEK | D6492 | PCR purification kit |
| GloMax Navigator Microplate Luminometer | Promega | GM2010 | Referred as multimode plate reader luminometer |
| HiScribe T7 Quick High Yield RNA synthesis Kit | New England Biolabs | E2050S | In-Vitro transcription kit |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | Cationic lipid transfection reagent |
| NanoDrop2000 | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | Used to measure DNA and RNA concentration |
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | Reduced serum media |
| Purelink RNA Mini Kit | Thermo Fisher Scientific | 12183018A | RNA purification kit |
| Vaccinia Capping System | New England Biolabs | M2080 | Capping system |
References
- Crick, F. H. On protein synthesis. Symposia of the Society for Experimental Biology. 12, 138-163 (1958).
- Crick, F. Central Dogma of Molecular Biology. Nature. 227, 561-563 (1970).
- Sonenberg, N., Hinnebusch, A. G. Regulation of Translation Initiation in Eukaryotes: Mechanisms and Biological Targets. Cell. 136, 731-745 (2009).
- Spriggs, K. A., Bushell, M., Willis, A. E. Translational Regulation of Gene Expression during Conditions of Cell Stress. Molecular Cell. 40, 228-237 (2010).
- Shchelkunov, S. N., Marennikova, S. S., Moyer, R. W. . Orthopoxviruses Pathogenic for Humans. , (2005).
- Gale, M., Tan, S. L., Katze, M. G. Translational Control of Viral Gene Expression in Eukaryotes. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 64, 239-280 (2000).
- Walsh, D., Mathews, M. B., Mohr, I. Tinkering with Translation: Protein Synthesis in Virus-Infected Cells. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5, a012351 (2013).
- Cao, S., Dhungel, P., Yang, Z. Going against the Tide: Selective Cellular Protein Synthesis during Virally Induced Host Shutoff. Journal of Virology. 91, e00071-e00017 (2017).
- Pelletier, J., Kaplan, G., Racaniello, V. R., Sonenberg, N. Cap-independent translation of poliovirus mRNA is conferred by sequence elements within the 5’ noncoding region. Molecular and Cellular Biology. 8, 1103-1112 (1988).
- Pelletier, J., Sonenberg, N. Internal initiation of translation of eukaryotic mRNA directed by a sequence derived from poliovirus RNA. Nature. 334, 320-325 (1988).
- Guo, L., Allen, E., Miller, W. A. Structure and function of a cap-independent translation element that functions in either the 3′ or the 5′ untranslated region. RNA. 6, 1808-1820 (2000).
- Simon, A. E., Miller, W. A. 3′ Cap-Independent Translation Enhancers of Plant Viruses. Annual Review of Microbiology. 67, 21-42 (2013).
- Marom, L., et al. Diverse poly(A) binding proteins mediate internal translational initiation by a plant viral IRES. RNA Biology. 6, 446-454 (2009).
- Liu, B., Qian, S. B. Translational reprogramming in cellular stress response. Wiley Interdisciplinary Review. RNA. 5, 301-305 (2014).
- Ahn, B. Y., Moss, B. Capped poly(A) leaders of variable lengths at the 5’ ends of vaccinia virus late mRNAs. Journal of Virology. 63, 226-232 (1989).
- Ahn, B. Y., Jones, E. V., Moss, B. Identification of the vaccinia virus gene encoding an 18-kilodalton subunit of RNA polymerase and demonstration of a 5’ poly(A) leader on its early transcript. Journal of Virology. 64, 3019-3024 (1990).
- Schwer, B., Visca, P., Vos, J. C., Stunnenberg, H. G. Discontinuous transcription or RNA processing of vaccinia virus late messengers results in a 5′ poly(A) leader. Cell. 50, 163-169 (1987).
- Yang, Z., Martens, C. A., Bruno, D. P., Porcella, S. F., Moss, B. Pervasive initiation and 3′ end formation of poxvirus post-replicative RNAs. Journal of Biological Chemistry. 287, 31050-31060 (2012).
- Dhungel, P., Cao, S., Yang, Z. The 5’-poly(A) leader of poxvirus mRNA confers a translational advantage that can be achieved in cells with impaired cap-dependent translation. PLOS Pathogens. 13, e1006602 (2017).
- Jha, S., et al. Trans-kingdom mimicry underlies ribosome customization by a poxvirus kinase. Nature. 546, 651-655 (2017).
- Dai, A., et al. Ribosome Profiling Reveals Translational Upregulation of Cellular Oxidative Phosphorylation mRNAs during Vaccinia Virus-Induced Host Shutoff. Journal of Virology. 91, e01858-e01816 (2017).
- De Silva, F. S., Moss, B. Origin-independent plasmid replication occurs in vaccinia virus cytoplasmic factories and requires all five known poxvirus replication factors. Journal of Virology. 2, 23 (2005).
- Yang, Z., Bruno, D. P., Martens, C. A., Porcella, S. F., Moss, B. Simultaneous high-resolution analysis of vaccinia virus and host cell transcriptomes by deep RNA sequencing. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107, 11513-11518 (2010).
- Yang, Z., Bruno, D. P., Martens, C. A., Porcella, S. F., Moss, B. Genome-Wide Analysis of the 5′ and 3′ Ends of Vaccinia Virus Early mRNAs Delineates Regulatory Sequences of Annotated and Anomalous Transcripts. Journal of Virology. 85, 5897-5909 (2011).
- Lorenz, T. C. Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies. Journal of Visualized Experiments. , (2012).
- Dieffenbach, C. W., Lowe, T. M., Dveksler, G. S. General concepts for PCR primer design. PCR Methods and Applications. 3, S30-S37 (1993).
- Innis, M. A., Gelfand, D. H., Sninsky, J. J., White, T. J. . PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications. , (2012).
- Baklanov, M. M., Golikova, L. N., Malygin, E. G. Effect on DNA Transcription of Nucleotide Sequences Upstream to T7 Promoter. Nucleic Acids Research. 24, 3659-3660 (1996).
- Thornton, J. A. Splicing by Overlap Extension PCR to Obtain Hybrid DNA Products. The Genetic Manipulation of Staphylococci: Methods and Protocols. , 43-49 (2017).
- Akichika, S., et al. Cap-specific terminal N6-methylation of RNA by an RNA polymerase II–associated methyltransferase. Science. , (2018).
- Sun, H., Zhang, M., Li, K., Bai, D., Yi, C. Cap-specific, terminal N6-methylation by a mammalian m6Am methyltransferase. Cell Research. 1, (2018).
- Boulias, K., et al. Identification of the m6Am methyltransferase PCIF1 reveals the location and functions of m6Am in the transcriptome. bioRxiv. , 485862 (2018).
- Dominissini, D., Rechavi, G. N4-acetylation of Cytidine in mRNA by NAT10 Regulates Stability and Translation. Cell. 175, 1725-1727 (2018).
- Wei, J., et al. Differential m6A, m6Am, and m1A Demethylation Mediated by FTO in the Cell Nucleus and Cytoplasm. Molecular Cell. 71, 973-985 (2018).
- Fu, Y., Dominissini, D., Rechavi, G., He, C. Gene expression regulation mediated through reversible m6A RNA methylation. Nature Reviews Genetics. 15, 293-306 (2014).
