JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunologie et infection

In vitro transcrit le test de reporter de luciférase basé sur l’ARN pour étudier la régulation de la traduction dans les cellules infectées par le poxvirus

Published: May 01, 2019
doi:
10.3791/59626
, , ,
1Division of Biology,Kansas State University

Summary

Nous présentons un protocole pour étudier la régulation de la traduction des mRNA dans les cellules infectées par le poxvirus à l’aide du test de reporter de luciférase basé sur l’ARN transcrit in vitro. Le dosage peut être utilisé pour étudier la régulation de la traduction par les éléments CISd’un mRNA, y compris la région 5 ‘-non traduite (UTR) et 3 ‘-UTR. Différents modes d’initiation de traduction peuvent également être examinés à l’aide de cette méthode.

Abstract

Chaque mRNA poxvirus transcrit après la réplication de l’ADN viral a un leader évolutif, non-basé sur le modèle 5 ‘-poly (A) dans le 5 ‘-UTR. Pour disséquer le rôle du 5 ‘-poly (A) chef de file dans la traduction d’ARNm pendant l’infection de poxvirus nous avons développé un essai in vitro transcrit de journaliste de luciférase basé sur l’ARN. Ce test de reporter comprend quatre étapes principales: (1) PCR pour amplifier le gabarit d’ADN pour la transcription in vitro; (2) transcription in vitro pour générer de l’ARNm à l’aide de l’ARN polymérase T7; (3) transfection pour introduire dans les cellules une ARNm transcrite in vitro; (4) détection de l’activité de la luciférase comme indicateur de la traduction. Le test de reporter de luciférase basé sur l’ARN décrit ici contourne les problèmes de réplication plasmidique dans les cellules infectées par le poxvirus et la transcription cryptique du plasmide. Ce protocole peut être utilisé pour déterminer la régulation de la traduction par des éléments CISdans un mRNA comprenant 5 ‘-UTR et 3 ‘-UTR dans des systèmes autres que les cellules infectées par le poxvirus. De plus, il est possible d’étudier différents modes d’initiation de la traduction, tels que le Cap-dépendant, le Cap-indépendant, la réinitiation et l’initiation interne à l’aide de cette méthode.

Introduction

Selon le dogme central, l’information génétique circule de l’ADN à l’ARN, puis finalement vers la protéine1,2. Ce flux d’information génétique est très réglementé à de nombreux niveaux, y compris la traduction de mRNA3,4. La mise au point de tests rapporteurs pour mesurer la régulation de l’expression génique facilitera la compréhension des mécanismes de réglementation impliqués dans ce processus. Nous décrivons ici un protocole pour étudier la traduction de l’ARNm à l’aide d’un test de transcription in vitro de la luciférase basée sur l’ARN dans les cellules infectées par le poxvirus.

Les poxvirus comprennent de nombreux agents pathogènes humains et animaux très dangereux5. Comme tous les autres virus, les poxvirus dépendent exclusivement des cellules hôtes pour la synthèse protéique6,7,8. Pour synthétiser efficacement les protéines virales, les virus ont évolué de nombreuses stratégies pour détourner les machines cellulaires translationnelles pour les rediriger vers la traduction des mRNAs viraux7,8. Un mécanisme couramment utilisé par les virus est d’utiliser des éléments d’action CISdans leurs transcriptions. Parmi les exemples notables, citons le site interne d’entrée de ribosome (IRES) et l’activateur de traduction indépendant du Cap (cite)9,10,11. Ces éléments CISrendent les transcriptions virales un avantage translationnel en attirant des machines translationnelles par divers mécanismes12,13,14. Plus de 100 mRNA de poxvirus ont un élément d’action CISévolutivement conservé dans la région 5 ‘-non traduite (5 ‘-UTR): un dirigeant de 5 ‘-poly (a) aux cinq extrémités de ces mRNAs15,16. Les longueurs de ces 5 ‘-poly (A) leaders sont hétérogènes et sont générées par le glissement de l’ARN polymérase encodée par le poxvirus pendant la transcription17,18. Nous, et d’autres, avons récemment découvert que le 5 ‘-poly (A) leader confère un avantage de traduction à un mRNA dans les cellules infectées par le virus de la vaccine (vacv), le membre prototypique des poxvirus19,20.

Le test de transcription de luciférase à base d’ARN transcrit in vitro a été initialement développé pour comprendre le rôle du 5 ‘-poly (A) leader dans la traduction d’ARNm au cours de l’infection par le poxvirus19,21. Bien que les tests de journaliste de luciférase basés sur l’ADN de plasmide aient été largement utilisés, il y a plusieurs inconvénients qui compliqueront l’interprétation des résultats dans les cellules infectées par le poxvirus. Premièrement, les plasmides sont capables de se reproduire dans les cellules infectées par le VACV22. Deuxièmement, la transcription cryptique se produit souvent à partir de l’ADN plasmide18,23,24. Troisièmement, la transcription pilotée par le promoteur VACV génère des poly (A)-leader de longueurs hétérogènes rendant ainsi difficile le contrôle de la longueur de leader poly (A) dans certaines expériences18. Un essai in vitro de transcription de luciférase basé sur l’ARN contourne ces questions et l’interprétation des données est simple.

Il y a quatre étapes clés dans cette méthode: (1) la réaction en chaîne de la polymérase (PCR) pour générer le modèle d’ADN pour la transcription in vitro; (2) transcription in vitro pour générer de l’ARNm; (3) transfection pour délivrer l’ARNm dans les cellules; et (4) la détection de l’activité de la luciférase comme indicateur de la traduction (figure 1). L’amplicon PCR qui en résulte contient les éléments suivants dans la direction 5 ‘à 3 ‘: T7-promoteur, leader poly (A) ou séquence 5 ‘-UTR souhaitée, cadre de lecture ouvert luciférase Firefly (ORF) suivi d’une queue poly (A). L’amplicon PCR est utilisé comme modèle pour synthétiser l’ARNm par transcription in vitro à l’aide de la T7 polymérase. Pendant la transcription in vitro, m7G Cap ou autre analogue de Cap est incorporé dans l’ARNm nouvellement synthétisé. Les transcriptions plafonnées sont transfectées en cellules infectées ou non infectées par le VACV. Le lysat cellulaire est recueilli au moment désiré après la transfection pour mesurer les activités de luciférase qui indiquent la production de protéines à partir de l’ARNm transfecté. Ce test reporter peut être utilisé pour étudier la régulation de la traduction par élément CISprésent dans 5 ‘-UTR, 3 ‘-UTR ou d’autres régions d’un ARNm. En outre, l’analyse in vitro transcrite à base d’ARN peut être utilisée pour étudier différents mécanismes d’initiation de la traduction, y compris l’initiation au Cap, l’initiation indépendante du capuchon, la réinitiation et l’initiation interne comme IRES.

Protocol

1. préparation du modèle d’ADN par PCR pour la transcription in vitro Pour préparer le modèle d’ADN par PCR, amorces de conception. Lors de la conception des amorces considèrent des caractéristiques cruciales comme la longueur de l’amorce, la température de recuit (Tm), le contenu GC, 3 ‘fin avec G ou C etc.Remarque: Discutés en détail dans ces ouvrages25,26,27<…

Representative Results

Les quatre étapes de l’analyse in vitro de la luciférase à base d’ARN transcrit: PCR pour générer un modèle d’ADN pour la transcription in vitro, la transcription in vitro pour générer l’ARNm, la transfection de l’ARNm et la mesure de la luciférase, peuvent être observées dans le diagramme schématique ( Figure 1). La conception des amorces pour les deux modèles d’ADN (Fluc et Rluc) et le schéma général de l’extension de surplomb …

Discussion

Toutes les étapes à quatre cœurs sont cruciales pour le succès de l’essai in vitro transcrit de la luciférase à base d’ARN. Une attention particulière doit être accordée à la conception des amorces, en particulier pour la séquence de promoteur T7. T7 RNA polymérase commence la transcription à partir du premier G souligné (gGG-5 ‘-UTR-Aug-) dans le promoteur T7 ajouté avant la séquence 5 ‘-UTR. Bien que le site de début de transcription (TSS) commence à partir du premier G à l’extrémité 5…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Le projet a été financé par les instituts nationaux de la santé (AI128406 www.nih.gov) à ZY et en partie par le centre de recherche sur le cancer Johnson (http://cancer.k-state.edu) sous la forme de la bourse d’été étudiants diplômés à la police.

Materials

2X-Q5 Master mix New England Biolabs M0492 High-Fidelity DNA Polymerase used in PCR
3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')G RNA Cap Structure Analog New England Biolabs S1411L Anti reverse Cap analog or ARCA
Corning 96 Well Half-Area white flat bottom polystyrene microplate Corning 3693 Opaque walled 96 well white plate with solid bottom
Dual-Luciferase Reporter Assay System Promega E1960 Dual-Luciferase Assay Kit (DLAK)
E.Z.N.A. Cycle Pure Kit OMEGA BIO-TEK D6492 PCR purification kit
GloMax Navigator Microplate Luminometer Promega GM2010 Referred as multimode plate reader luminometer
HiScribe T7 Quick High Yield RNA synthesis Kit New England Biolabs E2050S In-Vitro transcription kit
Lipofectamine 2000 Thermo Fisher Scientific 11668019 Cationic lipid transfection reagent
NanoDrop2000 Thermo Fisher Scientific ND-2000 Used to measure DNA and RNA concentration
Opti-MEM Thermo Fisher Scientific 31985070 Reduced serum media
Purelink RNA Mini Kit Thermo Fisher Scientific 12183018A RNA purification kit
Vaccinia Capping System New England Biolabs M2080 Capping system
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Crick, F. H. On protein synthesis. Symposia of the Society for Experimental Biology. 12, 138-163 (1958).
  2. Crick, F. Central Dogma of Molecular Biology. Nature. 227, 561-563 (1970).
  3. Sonenberg, N., Hinnebusch, A. G. Regulation of Translation Initiation in Eukaryotes: Mechanisms and Biological Targets. Cell. 136, 731-745 (2009).
  4. Spriggs, K. A., Bushell, M., Willis, A. E. Translational Regulation of Gene Expression during Conditions of Cell Stress. Molecular Cell. 40, 228-237 (2010).
  5. Shchelkunov, S. N., Marennikova, S. S., Moyer, R. W. . Orthopoxviruses Pathogenic for Humans. , (2005).
  6. Gale, M., Tan, S. L., Katze, M. G. Translational Control of Viral Gene Expression in Eukaryotes. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 64, 239-280 (2000).
  7. Walsh, D., Mathews, M. B., Mohr, I. Tinkering with Translation: Protein Synthesis in Virus-Infected Cells. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5, a012351 (2013).
  8. Cao, S., Dhungel, P., Yang, Z. Going against the Tide: Selective Cellular Protein Synthesis during Virally Induced Host Shutoff. Journal of Virology. 91, e00071-e00017 (2017).
  9. Pelletier, J., Kaplan, G., Racaniello, V. R., Sonenberg, N. Cap-independent translation of poliovirus mRNA is conferred by sequence elements within the 5’ noncoding region. Molecular and Cellular Biology. 8, 1103-1112 (1988).
  10. Pelletier, J., Sonenberg, N. Internal initiation of translation of eukaryotic mRNA directed by a sequence derived from poliovirus RNA. Nature. 334, 320-325 (1988).
  11. Guo, L., Allen, E., Miller, W. A. Structure and function of a cap-independent translation element that functions in either the 3′ or the 5′ untranslated region. RNA. 6, 1808-1820 (2000).
  12. Simon, A. E., Miller, W. A. 3′ Cap-Independent Translation Enhancers of Plant Viruses. Annual Review of Microbiology. 67, 21-42 (2013).
  13. Marom, L., et al. Diverse poly(A) binding proteins mediate internal translational initiation by a plant viral IRES. RNA Biology. 6, 446-454 (2009).
  14. Liu, B., Qian, S. B. Translational reprogramming in cellular stress response. Wiley Interdisciplinary Review. RNA. 5, 301-305 (2014).
  15. Ahn, B. Y., Moss, B. Capped poly(A) leaders of variable lengths at the 5’ ends of vaccinia virus late mRNAs. Journal of Virology. 63, 226-232 (1989).
  16. Ahn, B. Y., Jones, E. V., Moss, B. Identification of the vaccinia virus gene encoding an 18-kilodalton subunit of RNA polymerase and demonstration of a 5’ poly(A) leader on its early transcript. Journal of Virology. 64, 3019-3024 (1990).
  17. Schwer, B., Visca, P., Vos, J. C., Stunnenberg, H. G. Discontinuous transcription or RNA processing of vaccinia virus late messengers results in a 5′ poly(A) leader. Cell. 50, 163-169 (1987).
  18. Yang, Z., Martens, C. A., Bruno, D. P., Porcella, S. F., Moss, B. Pervasive initiation and 3′ end formation of poxvirus post-replicative RNAs. Journal of Biological Chemistry. 287, 31050-31060 (2012).
  19. Dhungel, P., Cao, S., Yang, Z. The 5’-poly(A) leader of poxvirus mRNA confers a translational advantage that can be achieved in cells with impaired cap-dependent translation. PLOS Pathogens. 13, e1006602 (2017).
  20. Jha, S., et al. Trans-kingdom mimicry underlies ribosome customization by a poxvirus kinase. Nature. 546, 651-655 (2017).
  21. Dai, A., et al. Ribosome Profiling Reveals Translational Upregulation of Cellular Oxidative Phosphorylation mRNAs during Vaccinia Virus-Induced Host Shutoff. Journal of Virology. 91, e01858-e01816 (2017).
  22. De Silva, F. S., Moss, B. Origin-independent plasmid replication occurs in vaccinia virus cytoplasmic factories and requires all five known poxvirus replication factors. Journal of Virology. 2, 23 (2005).
  23. Yang, Z., Bruno, D. P., Martens, C. A., Porcella, S. F., Moss, B. Simultaneous high-resolution analysis of vaccinia virus and host cell transcriptomes by deep RNA sequencing. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107, 11513-11518 (2010).
  24. Yang, Z., Bruno, D. P., Martens, C. A., Porcella, S. F., Moss, B. Genome-Wide Analysis of the 5′ and 3′ Ends of Vaccinia Virus Early mRNAs Delineates Regulatory Sequences of Annotated and Anomalous Transcripts. Journal of Virology. 85, 5897-5909 (2011).
  25. Lorenz, T. C. Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies. Journal of Visualized Experiments. , (2012).
  26. Dieffenbach, C. W., Lowe, T. M., Dveksler, G. S. General concepts for PCR primer design. PCR Methods and Applications. 3, S30-S37 (1993).
  27. Innis, M. A., Gelfand, D. H., Sninsky, J. J., White, T. J. . PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications. , (2012).
  28. Baklanov, M. M., Golikova, L. N., Malygin, E. G. Effect on DNA Transcription of Nucleotide Sequences Upstream to T7 Promoter. Nucleic Acids Research. 24, 3659-3660 (1996).
  29. Thornton, J. A. Splicing by Overlap Extension PCR to Obtain Hybrid DNA Products. The Genetic Manipulation of Staphylococci: Methods and Protocols. , 43-49 (2017).
  30. Akichika, S., et al. Cap-specific terminal N6-methylation of RNA by an RNA polymerase II–associated methyltransferase. Science. , (2018).
  31. Sun, H., Zhang, M., Li, K., Bai, D., Yi, C. Cap-specific, terminal N6-methylation by a mammalian m6Am methyltransferase. Cell Research. 1, (2018).
  32. Boulias, K., et al. Identification of the m6Am methyltransferase PCIF1 reveals the location and functions of m6Am in the transcriptome. bioRxiv. , 485862 (2018).
  33. Dominissini, D., Rechavi, G. N4-acetylation of Cytidine in mRNA by NAT10 Regulates Stability and Translation. Cell. 175, 1725-1727 (2018).
  34. Wei, J., et al. Differential m6A, m6Am, and m1A Demethylation Mediated by FTO in the Cell Nucleus and Cytoplasm. Molecular Cell. 71, 973-985 (2018).
  35. Fu, Y., Dominissini, D., Rechavi, G., He, C. Gene expression regulation mediated through reversible m6A RNA methylation. Nature Reviews Genetics. 15, 293-306 (2014).

Tags

In Vitro Transcribed RNALuciferase Reporter AssayTranslation RegulationPoxvirus-infected CellsPoly(A) Tail5’UTR3’UTRCap ModificationPCR AmpliconT7 PromoterFirefly LuciferaseRenilla LuciferaseKozak SequenceAgarose Gel Electrophoresis

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Dhungel, P., Cantu, F., Hernandez, C., Yang, Z. In Vitro Transcribed RNA-based Luciferase Reporter Assay to Study Translation Regulation in Poxvirus-infected Cells. J. Vis. Exp. (147), e59626, doi:10.3791/59626 (2019).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image