बाहर की ओर देख रहे हैं: Cyanobactrial जारी कार्बोहाइड्रेट पॉलिमर और प्रोटीन के अलगाव
Summary
यहाँ, साइनोबैक्टीरियल के अलगाव के लिए प्रोटोकॉल कार्बोहाइड्रेट पॉलिमर जारी किया और उनके exoproteomes के अलगाव का वर्णन कर रहे हैं. दोनों प्रक्रियाओं आगे विश्लेषण या अनुप्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि उच्च शुद्धता डिग्री के साथ पॉलिमर या प्रोटीन प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण कदम प्रतीक. वे भी आसानी से विशिष्ट उपयोगकर्ता की जरूरत के अनुसार अनुकूलित किया जा सकता है.
Abstract
सायनोबैक्टीरिया जैव अणुओं की एक विस्तृत श्रृंखला को बाह्य कोशिकीय वातावरण में सक्रिय रूप से स्रावित कर सकता है, जैसे कि हेटेरोपॉलीसैकेराइड और प्रोटीन। इन जैव अणुओं की पहचान और विशेषता उनके स्राव रास्ते के बारे में ज्ञान में सुधार कर सकते हैं और उन्हें हेरफेर करने में मदद कर सकते हैं। इसके अलावा, इन जैव अणुओं में से कुछ भी जैव प्रौद्योगिकी अनुप्रयोगों के संदर्भ में दिलचस्प हैं. यहाँ वर्णित साइनोबैक्टीरियल जारी कार्बोहाइड्रेट पॉलिमर और प्रोटीन के आसान और तेजी से अलगाव के लिए दो प्रोटोकॉल हैं. जारी कार्बोहाइड्रेट पॉलिमर के अलगाव के लिए विधि कार्बनिक सॉल्वैंट्स का उपयोग कर जलीय समाधान में polysaccharides की पारंपरिक वर्षा तकनीकों पर आधारित है। इस विधि बहुलक की विशेषताओं को बरकरार रखता है और एक साथ सेल मलबे और संस्कृति माध्यम से contaminants की उपस्थिति से बचा जाता है. प्रक्रिया के अंत में, lyophilized बहुलक इस्तेमाल किया जा करने के लिए तैयार है या विशेषता या शुद्धि के आगे दौर के अधीन किया जा सकता है, अंतिम इरादा उपयोग के आधार पर. सायनोबैक्टीरियल एक्सोप्रोटओम के अलगाव के बारे में, तकनीक सेंट्रीफ्यूगेशन और निस्पंदन द्वारा प्रमुख संदूषकों को हटाने के बाद सेल-मुक्त माध्यम की एकाग्रता पर आधारित है। इस रणनीति प्रोटीन है कि झिल्ली ट्रांसपोर्टरों या बाहरी झिल्ली vesicles के माध्यम से extracellular वातावरण तक पहुँचने के विश्वसनीय अलगाव के लिए अनुमति देता है. इन प्रोटीन बाद में मानक मास स्पेक्ट्रोमेट्री तकनीक का उपयोग कर पहचाना जा सकता है. यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल न केवल साइनोबैक्टीरिया की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए लागू किया जा सकता है, लेकिन यह भी अन्य जीवाणु उपभेदों के लिए. इसके अलावा, इन प्रक्रियाओं को आसानी से उत्पादों के अंतिम उपयोग के अनुसार सिलवाया जा सकता है, शुद्धता की डिग्री की आवश्यकता है, और जीवाणु तनाव.
Introduction
Cyanobacteria व्यापक रूप से वादा जैव प्रौद्योगिकी / इसलिए, साइनोबैक्टीरियल स्राव तंत्र को समझना और निष्कर्षण/पुनर्प्राप्ति विधियों के अनुकूलन को कुशल माइक्रोबियल सेल कारखानों के रूप में साइनोबैक्टीरिया को लागू करने के लिए आवश्यक है।
कई सायनोबैक्टीरियल उपभेदों को कोशिकीय बहुलक पदार्थ (ईपीएस) का उत्पादन करने में सक्षम हैं, जो मुख्य रूप से विषमपालिसैकेराइड द्वारा निर्मित होते हैं, जो कोशिका की सतह से जुड़े रहते हैं या मध्यम1में छोड़े जाते हैं। इन जारी कार्बोहाइड्रेट पॉलिमर अन्य बैक्टीरिया से उन लोगों की तुलना में अलग विशेषताएं हैं, जो उन्हें अनुप्रयोगों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए उपयुक्त बनाने (जैसे, antivirals2, इम्यूनोस्टिमुलेटरी3, एंटीऑक्सीडेंट4, धातु-चेलेटिंग5, पायसीकारी6, और दवा वितरण एजेंट7,8) . इन बहुलकों के पृथक्रूपन की पद्धति न केवल उपज में सुधार करती हैबल्कि 9 प्राप्त बहुलक के शुद्धता और विशिष्ट भौतिक गुणों में भी वृद्धि करती है . बहुलकों के पृथक्सन के लिए इन विधियों का एक विशाल बहुमत संस्कृति माध्यम से वर्षा रणनीतियों पर निर्भर करता है जो बहुलक के प्रबल एनिओनिक प्रकृति9,10के कारण आसानी से पूरा हो जाता है। इसके अलावा, वर्षण चरण में प्रयुक्त सॉल्वैंट्स को हटाने को वाष्पीकरण और/या lyophilization द्वारा तेजी से प्राप्त किया जा सकता है। पूर्वानुमेय आवेदन के आधार पर, अंतिम उत्पाद को अनुकूलित करने के लिए बहुलक वर्षा के बाद या उससे पहले अलग-अलग चरणों को युग्मित किया जा सकता है, जिसमें ट्राइक्लोरोऐसीटिक एसिड (टीसीए) उपचार, निस्पंदन, या आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी (एसईसी) शामिल हैं। स्तंभ शोधन10|
Cyanobacteria भी झिल्ली ट्रांसपोर्टरों पर निर्भर रास्ते के माध्यम से प्रोटीन की एक विस्तृत श्रृंखला स्रावित करने में सक्षम हैं (क्लासिक)11 या vesicles द्वारा मध्यस्थता (गैर शास्त्रीय)12. इसलिए, साइनोबैक्टीरियल एक्सोप्रोटओम का विश्लेषण एक आवश्यक उपकरण का गठन करता है, दोनों को समझने के लिए/ विश्वसनीय अलगाव और exoproteomes के विश्लेषण extracellular वातावरण की एकाग्रता की आवश्यकता है, के बाद से स्रावित प्रोटीन की बहुतायत अपेक्षाकृत कम है. इसके अलावा, अन्य भौतिक या रासायनिक कदम (उदा., सेंट्रीफ्यूगेशन, निस्पंदन, या प्रोटीन वर्षा) प्राप्त एक्सोप्रोटीओम की गुणवत्ता का अनुकूलन कर सकते हैं, प्रोटीन सामग्री को समृद्ध कर सकते हैं13, और contaminants की उपस्थिति से बचने (उदा, वर्णक, कार्बोहाइड्रेट आदि) 14 , 15 या नमूनों में इंट्रासेल्यूलर प्रोटीन की प्रधानता। हालांकि, इन चरणों में से कुछ भी प्रोटीन है कि पता लगाया जा सकता है के सेट को प्रतिबंधित कर सकते हैं, एक पक्षपाती विश्लेषण करने के लिए अग्रणी.
यह काम जारी कार्बोहाइड्रेट पॉलिमर और साइनोबैक्टीरिया संस्कृति मीडिया से exoproteomes के अलगाव के लिए कुशल प्रोटोकॉल का वर्णन करता है. इन प्रोटोकॉल आसानी से अध्ययन के विशिष्ट उद्देश्यों और उपयोगकर्ता की जरूरत के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, जबकि बुनियादी यहाँ प्रस्तुत कदम को बनाए रखने.
Protocol
Representative Results
Discussion
जीवाणु स्राव तंत्र को बेहतर ढंग से समझने और जारी किए गए उत्पादों का अध्ययन करने के लिए, अतिरिक्त कोशिकीय जीवाणु वातावरण में मौजूद जैव अणुओं के कुशल अलगाव और विश्लेषण को प्रदर्शित करना अत्यधिक महत्वपू?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को प्रतिस्पर्धा 2020 के माध्यम से Fundo Europeu desenvolvimento क्षेत्रीय (FEDER) धन द्वारा वित्त पोषण किया गया था – प्रतिस्पर्धा और अंतर्राष्ट्रीयकरण के लिए संचालन कार्यक्रम (POCI), पुर्तगाल 2020, और एफसीटी के माध्यम से पुर्तगाली धन द्वारा – Funda$o पैरा एक Cincia ई परियोजना POCI-01-0145-FEDER-028779 और अनुदान SFRH/BD/99715/2014 (CF) के ढांचे में एक Tecnologia /
Materials
| Dialysis membranes | Medicell Membranes Ltd | DTV.12000.07 | Visking Tubing Size 7, Dia 23.8 mm, Width 39-41 mm 30m Roll |
| Ethanol 96% | AGA – Álcool e Géneros Alimentares, S.A. | 4.000.02.02.00 | Fermentation ethyl alcohol 96% AGA |
| PES Filter 0.2 μm | Fisher Scientific, Lda | 15206869 | Syringe filter polystyrene 33MM 0.2µM STR |
| Amicon Ultra-15, Ultracel-3K | Merck Millipore Ltd. | UFC900324 | Centrifugal filters with a nominal molecular weight cut-off of 3 kDa |
| Thermo Scientific Pierce BCA Protein Assay | Fisher Scientific, Lda | 10741395 | Green-to-blue, precise, detergent-compatible assay reagent to measure total protein concentration |
| Brillant Blue G Colloidal Concentrate | Sigma Aldrich Química SL | B2025-1EA | Coomassie blue |
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