Ser udad: isolering af Cyanobakteriale frigivne kulhydratpolymerer og proteiner
Summary
Her beskrives protokoller for isolering af Cyanobakterielle frigivne kulhydratpolymerer og isolering af deres exoproteomer. Begge procedurer legemliggøre vigtige skridt til at opnå polymerer eller proteiner med høj renhed grader, der kan anvendes til yderligere analyse eller applikationer. De kan også nemt tilpasses efter specifikke brugerbehov.
Abstract
Cyanobakterier kan aktivt udskilte en bred vifte af biomolekyler i det ekstracellulære miljø, såsom heteropolysaccharider og proteiner. Identifikationen og karakteriseringen af disse biomolekyler kan forbedre kendskabet til deres udskillelsesveje og medvirke til at manipulere dem. Desuden er nogle af disse biomolekyler også interessante med hensyn til bioteknologiske anvendelser. Beskrevet her er to protokoller for nem og hurtig isolering af cyanobakteriale frigivne kulhydratpolymerer og proteiner. Metoden til isolering af frigivne kulhydratpolymerer er baseret på konventionelle udfældnings teknikker af polysaccharider i vandige opløsninger med organiske opløsningsmidler. Denne metode bevarer polymerens egenskaber og undgår samtidig tilstedeværelsen af forurenende stoffer fra cellerester og kulturmedium. Ved afslutningen af processen er den frysetørrede polymer klar til at blive brugt eller karakteriseret eller kan underkastes yderligere oprensnings runder afhængigt af den endelige tilsigtede anvendelse. Med hensyn til isolationen af cyanobakterial exoproteom er teknikken baseret på koncentrationen af det celle frie medium efter fjernelse af de vigtigste forurenende stoffer ved centrifugering og filtration. Denne strategi giver mulighed for pålidelig isolering af proteiner, der når frem til det ekstracellulære miljø via membran transportører eller ydre membran vesikler. Disse proteiner kan efterfølgende identificeres ved hjælp af standard massespektrometri teknikker. De protokoller, der præsenteres her, kan anvendes ikke kun til en bred vifte af cyanobakterier, men også til andre bakteriestammer. Desuden, disse procedurer kan let skræddersys i henhold til den endelige anvendelse af de produkter, renhedsgrad kræves, og bakteriel stamme.
Introduction
Cyanobakterier er bredt anerkendt som produktive kilder til naturlige produkter med lovende bioteknologiske/biomedicinske applikationer. Derfor er forståelse cyanobakteriale sekretions mekanismer og optimering af udvinding/nyttiggørelse metoder afgørende for at gennemføre cyanobakterier som effektive mikrobielle cellefabrikker.
Mange cyanobakteriale stammer er i stand til at producere ekstracellulære polymere stoffer (EPS), hovedsagelig dannet af heteropolysaccharider, der forbliver forbundet til cellens overflade eller frigives til mediet1. Disse frigivne kulhydratpolymerer har forskellige egenskaber sammenlignet med dem fra andre bakterier, som gør dem egnede til en bred vifte af anvendelser (f. eks. antivirale2, immunostimulatorisk3, antioxidant4, metal-chelating5, emulgerende6, og Drug levering agenter7,8). Metode til isolering af disse polymerer bidrager i høj grad ikke kun til bedre udbytte, men også til øget renhed og de specifikke fysiske egenskaber af polymer opnået9. Et stort flertal af disse metoder til isolering af polymerer er afhængige af udfældnings strategier fra det dyrkningsmedium, der let opnås på grund af polymerens stærke anioniske natur9,10. Desuden kan fjernelse af opløsningsmidler, der anvendes i udfældnings trinnet, hurtigt opnås ved fordampning og/eller lyofilisering. Afhængigt af den planlagte applikation kan forskellige trin kobles enten efter eller før polymer nedbør for at skræddersy det endelige produkt, som omfatter behandling af trichloreddikesyre (TCA), filtrering eller størrelses ekskluderings kromatografi (SEC) kolonne rensning10.
Cyanobakterier kan også udskille en lang række proteiner gennem veje, der er afhængige af membran transportører (klassisk)11 eller medieret af vesikler (ikke-klassisk)12. Derfor er analyse af cyanobakteriel exoproteom et vigtigt redskab, både til at forstå/manipulere cyanobakteriale protein sekretions mekanismer og forstå den specifikke ekstracellulære funktion af disse proteiner. Pålidelig isolation og analyse af exoproteomer kræver koncentrationen af det ekstracellulære miljø, da forekomsten af udskilte proteiner er relativt lav. Desuden kan andre fysiske eller kemiske trin (f. eks. centrifugering, filtrering eller protein fældning) optimere kvaliteten af det opnåede exoproteome, berige proteinindholdet13og undgå tilstedeværelsen af forurenende stoffer (f. eks. pigmenter, kulhydrater osv.) 14 , 15 eller over vægten af intracellulære proteiner i prøverne. Men nogle af disse trin kan også begrænse det sæt af proteiner, der kan påvises, hvilket fører til en partisk analyse.
Dette arbejde beskriver effektive protokoller for isolering af frigivne kulhydratpolymerer og exoproteomer fra cyanobakterier kultur medier. Disse protokoller kan let tilpasses undersøgelsens specifikke mål og brugernes behov, samtidig med at de grundlæggende trin, der præsenteres her, bevares.
Protocol
Representative Results
Discussion
For bedre at forstå bakterielle sekretions mekanismer og studere de frigivne produkter er det af yderste vigtighed at påvise effektiv isolation og analyse af de biomolekyler, der findes i det ekstracellulære bakterie miljø (f. eks. frigivet carbohydratpolymerer og proteiner).
Cyanobakteriale ekstracellulære kulhydratpolymerer er ekstremt komplekse, hovedsagelig på grund af antallet og andelen af forskellige monosaccharider, der udgør deres sammensætning1. De kon…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev finansieret af Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional (FEDER) midler gennem konkurrence 2020-Operacional programmet for konkurrenceevne og internationalisering (POCI), Portugal 2020, og af portugisiske fonde gennem FCT-Fundação para a Ciência e a tecnologia/Ministério da Ciência, tecnologia e ensino Superior inden for rammerne af projektet POCI-01-0145-FEDER-028779 og Grant SFRH/BD/99715/2014 (CF).
Materials
| Dialysis membranes | Medicell Membranes Ltd | DTV.12000.07 | Visking Tubing Size 7, Dia 23.8 mm, Width 39-41 mm 30m Roll |
| Ethanol 96% | AGA – Álcool e Géneros Alimentares, S.A. | 4.000.02.02.00 | Fermentation ethyl alcohol 96% AGA |
| PES Filter 0.2 μm | Fisher Scientific, Lda | 15206869 | Syringe filter polystyrene 33MM 0.2µM STR |
| Amicon Ultra-15, Ultracel-3K | Merck Millipore Ltd. | UFC900324 | Centrifugal filters with a nominal molecular weight cut-off of 3 kDa |
| Thermo Scientific Pierce BCA Protein Assay | Fisher Scientific, Lda | 10741395 | Green-to-blue, precise, detergent-compatible assay reagent to measure total protein concentration |
| Brillant Blue G Colloidal Concentrate | Sigma Aldrich Química SL | B2025-1EA | Coomassie blue |
References
- Pereira, S., et al. Complexity of cyanobacterial exopolysaccharides: composition, structures, inducing factors and putative genes involved in their biosynthesis and assembly. FEMS Microbiology Reviews. 33 (5), 917-941 (2009).
- Kanekiyo, K., et al. Isolation of an Antiviral Polysaccharide, Nostoflan, from a Terrestrial Cyanobacterium, Nostoc flagelliforme. Journal of Natural Products. 68 (7), 1037-1041 (2005).
- Løbner, M., Walsted, A., Larsen, R., Bendtzen, K., Nielsen, C. H. Enhancement of human adaptive immune responses by administration of a high-molecular-weight polysaccharide extract from the cyanobacterium Arthrospira platensis. Journal of Medicinal Food. 11 (2), 313-322 (2008).
- Wang, H. B., Wu, S. J., Liu, D. Preparation of polysaccharides from cyanobacteria Nostoc commune and their antioxidant activities. Carbohydrate Polymers. 99, 553-555 (2014).
- Ozturk, S., Aslim, B., Suludere, Z., Tan, S. Metal removal of cyanobacterial exopolysaccharides by uronic acid content and monosaccharide composition. Carbohydrate Polymers. 101, 265-271 (2014).
- Han, P. P., et al. Emulsifying, flocculating, and physicochemical properties of exopolysaccharide produced by cyanobacterium Nostoc flagelliforme. Applied Biochemistry and Biotechnology. 172 (1), 36-49 (2014).
- Leite, J. P., et al. Cyanobacterium‐Derived Extracellular Carbohydrate Polymer for the Controlled Delivery of Functional Proteins. Macromolecular Bioscience. 17 (2), 1600206 (2017).
- Estevinho, B. N., et al. Application of a cyanobacterial extracellular polymeric substance in the microencapsulation of vitamin B12. Powder Technology. 343, 644-651 (2019).
- Klock, J. H., Wieland, A., Seifert, R., Michaelis, W. Extracellular polymeric substances (EPS) from cyanobacterial mats: characterisation and isolation method optimisation. Marine Biology. 152 (5), 1077-1085 (2007).
- Delattre, C., Pierre, G., Laroche, C., Michaud, P. Production, extraction and characterization of microalgal and cyanobacterial exopolysaccharides. Biotechnology Advances. 34 (7), 1159-1179 (2016).
- Costa, T. R., et al. Secretion systems in gram-negative bacteria: structural and mechanistic insights. Nature Reviews Microbiology. 13 (6), 343-359 (2015).
- Roier, S., Zingl, F. G., Cakar, F., Schild, S. Bacterial outer membrane vesicle biogenesis: a new mechanism and its implications. Microbial Cell. 3 (6), 257-259 (2016).
- Sergeyenko, T. V., Los, D. A. Identification of secreted proteins of the cyanobacterium Synechocystis sp. strain PCC 6803. FEMS Microbiology Letters. 193 (2), 213-216 (2000).
- Oliveira, P., et al. The versatile TolC-like Slr1270 in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. Environmental Microbiology. 18 (2), 486-502 (2016).
- Flores, C., et al. The alternative sigma factor SigF is a key player in the control of secretion mechanisms in Synechocystis sp. PCC 6803. Environmental Microbiology. 21 (1), 343-359 (2018).
- Dubois, M., Gilles, K. A., Hamilton, J. K., Rebers, P. A., Smith, F. Colorimetric method for determination of sugars and related substances. Analytical Chemistry. 28 (3), 350-356 (1956).
- Parikh, A., Madamwar, D. Partial characterization of extracellular polysaccharides from cyanobacteria. Bioresource Technology. 97 (15), 1822-1827 (2006).
- Rühmann, B., Schmid, J., Sieber, V. Methods to identify the unexplored diversity of microbial exopolysaccharides. Frontiers in Microbiology. 6, 565 (2015).
- Pathak, J., Rajneesh, R., Sonker, A. S., Kannaujiya, V. K., Sinha, R. P. Cyanobacterial extracellular polysaccharide sheath pigment, scytonemin: A novel multipurpose pharmacophore. Marine Glycobiology. , 343-358 (2016).
- Nguyen, A. T. B., et al. Performances of different protocols for exocellular polysaccharides extraction from milk acid gels: Application to yogurt. Food Chemistry. 239, 742-750 (2018).
- Jamshidian, H., Shojaosadati, S. A., Mousavi, S. M., Soudi, M. R., Vilaplana, F. Implications of recovery procedures on structural and rheological properties of schizophyllan produced from date syrup. International Journal of Biological Macromolecules. 105, 36-44 (2017).
- Couto, N., Schooling, S. R., Dutcher, J. R., Barber, J. Proteome profiles of outer membrane vesicles and extracellular matrix of Pseudomonas aeruginosa biofilms. Journal of Proteome Research. 14 (10), 4207-4222 (2015).
