מבט כלפי חוץ: בידוד של Cyanobacterial שוחרר פולימרים פחמימות וחלבונים
Summary
כאן, פרוטוקולים עבור בידוד של cyanobacterial שוחרר פולימרים פחמימות ובידוד של exoproteomes שלהם מתוארים. שני ההליכים לגלם שלבים מרכזיים כדי להשיג פולימרים או חלבונים עם דרגות טוהר גבוהה, כי ניתן להשתמש לניתוח נוסף או יישומים. הם יכולים גם להיות מותאמים בקלות בהתאם לצרכים ספציפיים של המשתמש.
Abstract
כחוליות יכול להפריש באופן פעיל מגוון רחב של biomolecules לתוך הסביבה החילוץ, כגון הפשפשים וחלבונים. ההזדהות והאפיון של biomolecules אלה יכולים לשפר את הידע על משעולים הפרשה שלהם ולעזור לתמרן אותם. יתרה מזאת, חלק מbiomolecules הללו מעניינים גם במונחים של יישומים ביו-טכנולוגיים. המתואר כאן הם שני פרוטוקולים עבור בידוד קל ומהיר של cyanobacterial שוחרר פולימרים פחמימות וחלבונים. השיטה לבידוד של פולימרים שפורסמו מבוססת על טכניקות משקעים קונבנציונליים של פוליסכרידים בפתרונות מימית באמצעות ממיסים אורגניים. שיטה זו משמרת את מאפייני הפולימר ובמקביל נמנעת מנוכחותם של מזהמים מפסולת התא וממדיום תרבותי. בסופו של התהליך, פולימר ליאופהיזה מוכן לשמש או מאופיין או יכול להיות נתון לסיבובים נוספים של טיהור, בהתאם לשימוש סופי מיועד. בנוגע לבידוד של cyanobacterial exoproteome, הטכניקה מבוססת על ריכוז של מדיום ללא תא לאחר הסרת המזהמים העיקריים על ידי צנטריפוגה וסינון. אסטרטגיה זו מאפשרת בידוד אמין של חלבונים המגיעים לתחומי החילוץ באמצעות מובילי הממברנה או שלפוחיות הקרום החיצוני. חלבונים אלה יכולים להיות מזוהים לאחר מכן באמצעות טכניקות המסה סטנדרטי ספקטרומטריה. הפרוטוקולים המוצגים כאן ניתן להחיל לא רק על מגוון רחב של כחוליות, אלא גם על זנים חיידקיים אחרים. יתר על כן, הליכים אלה יכולים להיות מותאמים בקלות על פי השימוש הסופי של המוצרים, תואר הטוהר הנדרש, והזן חיידקי.
Introduction
כחוליות מוכרות באופן נרחב כמקורות פורה של מוצרים טבעיים עם יישומים מבטיחים ביו-טכנולוגיים/ביו-רפואיים. לכן, הבנת מנגנוני הפרשה cyanobacterial ואופטימיזציה של שיטות החילוץ/שחזור חיוניים כדי ליישם cyanחיידקים יעילים מפעלים תאים מיקרוביאלית.
זנים cyanobacterial רבים מסוגלים לייצר חומרים פולימריים מסחטות (EPS), שנוצרו בעיקר על ידי הפשפשים, כי להישאר משויך משטח התא או משתחררים לתוך המדיום1. אלה פולימרים פחמימות שפורסמו יש תכונות נפרדות לעומת אלה של חיידקים אחרים, אשר להפוך אותם מתאימים עבור מגוון רחב של יישומים (למשל, נוגדנים2, מגירוי חיסוני3, נוגד חמצון4, מתכת-הכלפת5, אמולסיה6, וסוכני משלוח הסמים7,8). מתודולוגיה לבידוד של פולימרים אלה תורמת בעיקר לא רק כדי לשפר את התשואה אלא גם להגדיל את הטוהר ואת התכונות הפיזיות הספציפיות של הפולימר השיג9. רוב עצום של שיטות אלה לבידוד של פולימרים להסתמך על אסטרטגיות משקעים מתוך מדיום התרבות כי הם מושגת בקלות בשל הטבע האנייוני חזק של הפולימר9,10. בנוסף, הסרת ממיסים המשמשים בשלב המשקעים יכולה להיות מושגת במהירות על ידי אידוי ו/או ליזוליזציה. בהתאם ליישום מיוצג, שלבים שונים יכולים להיות ביחד או לאחר או לפני משקעים פולימריים על מנת להתאים את המוצר הסופי, הכוללים חומצת חומץ triכלור (TCA) טיפול, סינון, או כרומטוגרפיה הדרה (SEC) הטור טיהור10.
כחוליות מסוגלות גם להפריש מגוון רחב של חלבונים באמצעות מסלולים התלויים בטרנספורטי קרום (קלאסי)11 או בתיווך על ידי שלפוחיות (לא קלאסית)12. לכן, ניתוח של cyanexoproteome terial מהווה כלי חיוני, הן כדי להבין/לתמרן הפרשת חלבון cyanobacterial מנגנונים ולהבין את הפונקציה החילוץ ספציפיים של חלבונים אלה. הבידוד האמין והניתוח של הexoproteomes דורשים את הריכוז של הסביבה המועטה, שכן השפע של החלבונים מופרש נמוך יחסית. בנוסף, צעדים פיזיים או כימיים אחרים (למשל, צנטריפוגה, סינון או משקעים בחלבון) עשויים למטב את איכות הexoproteome המתקבלת, להעשיר את תוכן החלבון13, ולהימנע מנוכחות מזהמים (למשל, פיגמנטים, פחמימות, וכו‘) מיכל בן 14 , 15 או שליטה מראש של חלבונים תאיים בדגימות. עם זאת, חלק מהשלבים הללו עשויים גם להגביל את ערכת החלבונים שניתן לאתרם, המובילה לניתוח מוטה.
עבודה זו מתארת פרוטוקולים יעילים לבידוד של פולימרים משוחררים של פחמימות וexoproteomes מתוך מדיה של התרבות הקיאנקטריה. פרוטוקולים אלה ניתן להתאים בקלות את המטרות הספציפיות של המחקר ואת צורכי המשתמש, תוך שמירה על הצעדים הבסיסיים המוצגים כאן.
Protocol
Representative Results
Discussion
כדי להבין טוב יותר מנגנוני הפרשה חיידקיים וללמוד את המוצרים שפורסמו, זה חשוב ביותר כדי להדגים את הבידוד יעיל וניתוח של הbiomolecules הנוכחי בסביבה חיידקי החילוץ (כגון שוחרר פולימרים של פחמימות וחלבונים).
מסחטות cyanobacterial פולימרים פחמימות מורכבים מאוד, בעיקר בשל מספר ופרופורציה של …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו היתה ממומנת על ידי Fundo אירופu de Desenvolvimento האזורית (פדר) קרנות באמצעות 2020 להתחרות-תוכנית Operacional לתחרותיות ובאינטראלליזציה (POCI), פורטוגל 2020, ועל ידי כספים פורטוגזית דרך FCT-Funda, הסדרה האלקטרונית e Tecnoלוג/Ministério da Ciência, Tecnoלוגיה e Ensino מעולה במסגרת הפרויקט POCI-01-0145-פדר-028779 והענק SFRH/BD/99715/2014 (CF).
Materials
| Dialysis membranes | Medicell Membranes Ltd | DTV.12000.07 | Visking Tubing Size 7, Dia 23.8 mm, Width 39-41 mm 30m Roll |
| Ethanol 96% | AGA – Álcool e Géneros Alimentares, S.A. | 4.000.02.02.00 | Fermentation ethyl alcohol 96% AGA |
| PES Filter 0.2 μm | Fisher Scientific, Lda | 15206869 | Syringe filter polystyrene 33MM 0.2µM STR |
| Amicon Ultra-15, Ultracel-3K | Merck Millipore Ltd. | UFC900324 | Centrifugal filters with a nominal molecular weight cut-off of 3 kDa |
| Thermo Scientific Pierce BCA Protein Assay | Fisher Scientific, Lda | 10741395 | Green-to-blue, precise, detergent-compatible assay reagent to measure total protein concentration |
| Brillant Blue G Colloidal Concentrate | Sigma Aldrich Química SL | B2025-1EA | Coomassie blue |
References
- Pereira, S., et al. Complexity of cyanobacterial exopolysaccharides: composition, structures, inducing factors and putative genes involved in their biosynthesis and assembly. FEMS Microbiology Reviews. 33 (5), 917-941 (2009).
- Kanekiyo, K., et al. Isolation of an Antiviral Polysaccharide, Nostoflan, from a Terrestrial Cyanobacterium, Nostoc flagelliforme. Journal of Natural Products. 68 (7), 1037-1041 (2005).
- Løbner, M., Walsted, A., Larsen, R., Bendtzen, K., Nielsen, C. H. Enhancement of human adaptive immune responses by administration of a high-molecular-weight polysaccharide extract from the cyanobacterium Arthrospira platensis. Journal of Medicinal Food. 11 (2), 313-322 (2008).
- Wang, H. B., Wu, S. J., Liu, D. Preparation of polysaccharides from cyanobacteria Nostoc commune and their antioxidant activities. Carbohydrate Polymers. 99, 553-555 (2014).
- Ozturk, S., Aslim, B., Suludere, Z., Tan, S. Metal removal of cyanobacterial exopolysaccharides by uronic acid content and monosaccharide composition. Carbohydrate Polymers. 101, 265-271 (2014).
- Han, P. P., et al. Emulsifying, flocculating, and physicochemical properties of exopolysaccharide produced by cyanobacterium Nostoc flagelliforme. Applied Biochemistry and Biotechnology. 172 (1), 36-49 (2014).
- Leite, J. P., et al. Cyanobacterium‐Derived Extracellular Carbohydrate Polymer for the Controlled Delivery of Functional Proteins. Macromolecular Bioscience. 17 (2), 1600206 (2017).
- Estevinho, B. N., et al. Application of a cyanobacterial extracellular polymeric substance in the microencapsulation of vitamin B12. Powder Technology. 343, 644-651 (2019).
- Klock, J. H., Wieland, A., Seifert, R., Michaelis, W. Extracellular polymeric substances (EPS) from cyanobacterial mats: characterisation and isolation method optimisation. Marine Biology. 152 (5), 1077-1085 (2007).
- Delattre, C., Pierre, G., Laroche, C., Michaud, P. Production, extraction and characterization of microalgal and cyanobacterial exopolysaccharides. Biotechnology Advances. 34 (7), 1159-1179 (2016).
- Costa, T. R., et al. Secretion systems in gram-negative bacteria: structural and mechanistic insights. Nature Reviews Microbiology. 13 (6), 343-359 (2015).
- Roier, S., Zingl, F. G., Cakar, F., Schild, S. Bacterial outer membrane vesicle biogenesis: a new mechanism and its implications. Microbial Cell. 3 (6), 257-259 (2016).
- Sergeyenko, T. V., Los, D. A. Identification of secreted proteins of the cyanobacterium Synechocystis sp. strain PCC 6803. FEMS Microbiology Letters. 193 (2), 213-216 (2000).
- Oliveira, P., et al. The versatile TolC-like Slr1270 in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. Environmental Microbiology. 18 (2), 486-502 (2016).
- Flores, C., et al. The alternative sigma factor SigF is a key player in the control of secretion mechanisms in Synechocystis sp. PCC 6803. Environmental Microbiology. 21 (1), 343-359 (2018).
- Dubois, M., Gilles, K. A., Hamilton, J. K., Rebers, P. A., Smith, F. Colorimetric method for determination of sugars and related substances. Analytical Chemistry. 28 (3), 350-356 (1956).
- Parikh, A., Madamwar, D. Partial characterization of extracellular polysaccharides from cyanobacteria. Bioresource Technology. 97 (15), 1822-1827 (2006).
- Rühmann, B., Schmid, J., Sieber, V. Methods to identify the unexplored diversity of microbial exopolysaccharides. Frontiers in Microbiology. 6, 565 (2015).
- Pathak, J., Rajneesh, R., Sonker, A. S., Kannaujiya, V. K., Sinha, R. P. Cyanobacterial extracellular polysaccharide sheath pigment, scytonemin: A novel multipurpose pharmacophore. Marine Glycobiology. , 343-358 (2016).
- Nguyen, A. T. B., et al. Performances of different protocols for exocellular polysaccharides extraction from milk acid gels: Application to yogurt. Food Chemistry. 239, 742-750 (2018).
- Jamshidian, H., Shojaosadati, S. A., Mousavi, S. M., Soudi, M. R., Vilaplana, F. Implications of recovery procedures on structural and rheological properties of schizophyllan produced from date syrup. International Journal of Biological Macromolecules. 105, 36-44 (2017).
- Couto, N., Schooling, S. R., Dutcher, J. R., Barber, J. Proteome profiles of outer membrane vesicles and extracellular matrix of Pseudomonas aeruginosa biofilms. Journal of Proteome Research. 14 (10), 4207-4222 (2015).
