Vi præsenterer teknikker til isolering, dyrkning, karakterisering og differentiering af humane primære muskel stamceller (Hmpc’er) opnået fra skeletmuskulatur biopsi væv. hmpcs opnået og karakteriseret gennem disse metoder kan bruges til efterfølgende at behandle forskningsspørgsmål relateret til human myogenesis og skeletmuskulatur regenerering.
Brugen af primære humane væv og celler er ideel til undersøgelse af biologiske og fysiologiske processer såsom skeletmuskulaturen regenerativ proces. Der er anerkendte udfordringer for at arbejde med humane primære voksne stamceller, især humane muskelprogenitorceller (Hmpc’er) afledt af skeletmuskulatur biopsier, herunder lavt celle udbytte fra indsamlet væv og en stor grad af donor heterogenitet af vækst og død parametre blandt kulturer. Mens indarbejdelse af heterogenitet i eksperimentel design kræver en større stikprøvestørrelse til at opdage betydelige virkninger, det giver os også mulighed for at identificere mekanismer, der ligger til grund for variabilitet i hMPC udvidelseskapacitet, og dermed giver os mulighed for bedre at forstå heterogenitet i skeletmuskulatur regenerering. Nye mekanismer, der skelner ekspansions evne af kulturer har potentiale til at føre til udvikling af terapier til at forbedre skeletmuskulatur regenerering.
Skeletmuskulatur er det største organsystem i den menneskelige krop, der tegner sig for 30 − 40% af hele kroppen masse1. Ud over sin anerkendte rolle i bevægelse, skeletmuskulatur bevarer kropstemperatur og kropsholdning, og spiller en central rolle i hele kroppen næringsstof homøostase. Forskning, der involverer menneskelige deltagere, dyr, og cellekultur modeller er alle værdifulde til at løse spørgsmål vedrørende skeletmuskulatur biologi og regenerering. Isolation og kultur af humane primære muskel stamceller (Hmpc’er) giver en robust model, der giver mulighed for cellekultur teknikker og manipulationer, der skal anvendes til humane prøver. En fordel ved at bruge hmpcs er, at de bevarer den genetiske og metaboliske fænotype fra hver donor2,3. Vedligeholdelse af donor fænotype giver forskerne mulighed for at undersøge den interindividuelle variation i den myogene proces. Vi har for eksempel anvendt vores hMPC-karakteriserings metode til at identificere alders-og kønsrelaterede forskelle i hMPC-befolkningens udvidelseskapacitet4.
Formålet med denne protokol er at detaljeret teknikker til at isolere, kultur, karakterisere, og differentiere hMPCs fra skeletmuskulatur biopsi væv. På grundlag af tidligere arbejde, der beskrev hmpcs og identificerede potentielle celle overflade beslutningstagere for HMPC isolation5,6, denne protokol fylder en kritisk kløft i viden ved at forbinde isolation til karakterisering af hmpcs. Desuden gør de detaljerede trin-for-trin instruktioner inkluderet i denne protokol hMPC isolation og karakterisering tilgængelig for en bred videnskabelig publikum, herunder dem med begrænset erfaring med hMPCs. Vores protokol er blandt de første til at beskrive brugen af et billedbehandlings-flowcytometer til at spore cellepopulationer. Nydesignede billedbehandlings cytometre er state-of-the-art, High-gennemløb, og Micro Plate-baseret, der muliggør Live Cell Imaging, celletælling, og multikanal fluorescens analyse af alle celler i hver brønd af et kultur fartøj inden for minutter. Dette system giver mulighed for hurtig kvantificering af dynamiske ændringer i spredningen og levedygtigheden af en hel cellepopulation med kun minimal forstyrrelse af kulturen. For eksempel er vi i stand til at udføre objektive foranstaltninger for sammenløbet på hinanden følgende dage in vitro til at bestemme vækst kinetik af hver kultur, der stammer fra forskellige donorer. Mange protokoller i litteraturen, især dem, der involverer differentiering af MPCs, kræver celler til at nå et defineret niveau af sammenløbet før påbegyndelse af differentiering eller behandling7. Vores metode giver mulighed for objektiv bestemmelse af sammenløbet af hver brønd i en kultur fartøj giver forskerne mulighed for at indlede behandling på en upartisk, ikke-subjektiv måde.
Tidligere var en væsentlig begrænsning af brugen af primære Hmpc’er lave udbytter, der begrænser antallet af celler, der er tilgængelige til eksperimenter. Vi og andre har vist udbyttet af MPCs fra skeletmuskulatur biopsi væv er 1 − 15 MPCs per milligram af væv (figur 1)8. Da vores protokol tillader fire passager i cellerne før rensning med fluorescens aktiverede celle sortering (FACS), er vores kryopræserverede HMPC-udbytter, der er afledt af små mængder biopsi-væv (50 − 100 mg), tilstrækkelige til at løse forskningsformål, hvor der kræves flere eksperimenter. Vores FACS-protokol producerer en ~ 80% ren (Pax7 positiv) MPC-population, således at vores protokol er optimeret til både udbytte og renhed.
Primære hmpc’er er en vigtig forskningsmodel, der bruges til at forstå skeletmuskulatur biologi og den regenerativ proces. Derudover har Hmpc’er potentialet til at blive brugt til behandling. Der er dog anerkendte udfordringer ved at bruge primære Hmpc’er til både forskning og terapi, herunder den begrænsede forståelse af celler afledt af mennesker10. Der er også en stor grad af variation i ekspansions kapaciteten blandt donor kulturer, som begrænser potentialet for brug af Hmpc’er og kan …
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takker Cornell University, bioteknologi Resource Center Imaging facilitet for deres hjælp med fluorescens aktiveret celle sortering. Vi takker også Molly Gheller for hendes hjælp med deltageren rekruttering og Erica Bender for at gennemføre skeletmuskulatur biopsier. Endelig takker vi deltagerne for deres tid og deltagelse i studiet. Dette arbejde blev støttet af det nationale Institut for aldring af de nationale institutter for sundhed under Award nummer R01AG058630 (til B.D.C. og A.E.T.), af en Glenn Foundation for Medical Research og American Federation for aging forskning Grant for Junior Faculty (til B . D.C.), og af præsidentens råd for Cornell Women (til A.E.T.).
0.25% Trypsin, 2.21 mM EDTA | Corning | 25-053-Cl | Trypsin used for removing adherent hMPCs from cell culture vessels |
10 cm cell culture plate | VWR | 664160 | Plates used for culturing hMPCs |
15 mL Falcon tube | Falcon | 352196 | 15 mL conical tubes used throughout the hMPC isolation and culturing protocols |
24 well cell culture plate | Grenier Bio-One | 662 160 | Plates used for culturing hMPCs |
7-AAD Viability Staining Solution | eBioscience | 00-6993-50 | Viability stain for identifying living cells during FACS sorting |
Alexa Fluor 488 anti-human CD29, Clone: TS2/16 | BioLegend | 303016 | Conjugated antibody for FACS |
Black 96-well cell culture plate | Grenier Bio-One | 655079 | 96-well cell culture plate ideal for fluorescent imaging using the Celigo S |
Celigo S | Nexcelcom Bioscience | Imaging cytometer used to track hMPC cultures | |
Cell Strainer | VWR | 352350 | Cell strainer to eliminate large pieces of debris during muscle biopsy processing |
Collagen Type I (Rat Tail) | Corning | 354236 | Collagen for coating cell culture plates |
Collagenase D | Roche | 11 088 882 001 | Used for degradation of collagen and other connective tissue in the skeletal muscle biopsy tissue |
Dimethyl Sulfoxide | VWR | WN182 | Used for cryopreservation of hMPCs |
Dispase II | Sigma Life Sciences | D4693 | A protease used for enzymatic digestion of skeletal muscle biopsy tissue |
Dulbecco's Modified Eagle Medium Low Glucose powder | Gibco | 31600-034 | Low glucose DMEM for muscle biopsy processing |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Gibco | 21600-010 | PBS for muscle biopsy processing |
EDTA Disodium Salt Dihydrate | J.T. Baker | 4040-01 | Required for FACS buffer |
Fetal Bovine Serum | VWR | 89510-186 | Fetal bovine serum used for hMPC growth media |
Ham's F12 | Gibco | 21700-026 | Base media for hMPCs |
Heat Inactivated Equine Serum | Gibco | 26-050-070 | Horse serum used to make hMPC differentiation media |
Hemocytometer | iNCyto | DHC-N0105 | Used to count cells |
Hibernate A | Gibco | A1247501 | Media for preserving skeletal muscle biopsy tissue |
Hoechst 33342, trihydrochloride, trihydrate | Life Technologies | H21492 | DNA stain for identifying all cells using the Celigo S |
Isopropanol | Fisher Scientific | A416P-4 | Used for controlled rate freezing of hMPCs |
Moxi buffer | Orflo | MXA006 | Buffer for automated cell counter |
Moxi Cassettes | Orflo | MXC002 | Cassesttes for automated cell counter |
Moxi z Mini Automated Cell Counter | Orflo | Automated cell counter | |
Mr. Frosty Freezing Container | Thermo Fisher Scientific | 5100-0001 | Commerically available controlled rate cell freezing container |
Normal Goat Serum (10%) | Thermo Fisher Scientific | 50062Z | Goat serum used in FACS buffer |
PE-Cy7 Mouse Anti-human CD56 , Clone: B159 | BD Pharmingen | 557747 | Conjugated antibody for FACS |
Penicillin/Streptomycin 100X Solution | Corning | 30-002-CI | Antibiotics added to culture media |
Propidium iodide | Thermo Fisher Scientific | P3566 | DNA stain for identifying dead cells using the Celigo S |
Recombinant Human basic fibroblast growth factor | Promega | G5071 | Supplement in hMPC growth media to prevent spontaneous differentiation |
Recovery Cell Culture Freezing Medium | Gibco | 12648-010 | Media used to cryoperseve muscle biopsy slurries |
Sodium Bicarbonate | Fisher Scientific | S233-3 | Added to Ham's F12 |
Sterile Round Bottom 5 mL tubes | VWR | 60818-565 | Tubes used for FACS |
UltraComp eBeads | eBioscience | 01-2222-42 | Compensation beads fort calibrating flow FACS settings |