Isolation, kultur, karakterisering og differentiering af humane muskel stamceller fra skeletmuskulaturen biopsi procedure

Skeletmuskulatur er det største organsystem i den menneskelige krop, der tegner sig for 30 − 40% af hele kroppen masse¹. Ud over sin anerkendte rolle i bevægelse, skeletmuskulatur bevarer kropstemperatur og kropsholdning, og spiller en central rolle i hele kroppen næringsstof homøostase. Forskning, der involverer menneskelige deltagere, dyr, og cellekultur modeller er alle værdifulde til at løse spørgsmål vedrørende skeletmuskulatur biologi og regenerering. Isolation og kultur af humane primære muskel stamceller (Hmpc’er) giver en robust model, der giver mulighed for cellekultur teknikker og manipulationer, der skal anvendes til humane prøver. En fordel ved at bruge hmpcs er, at de bevarer den genetiske og metaboliske fænotype fra hver donor^2,3. Vedligeholdelse af donor fænotype giver forskerne mulighed for at undersøge den interindividuelle variation i den myogene proces. Vi har for eksempel anvendt vores hMPC-karakteriserings metode til at identificere alders-og kønsrelaterede forskelle i hMPC-befolkningens udvidelseskapacitet⁴.

Formålet med denne protokol er at detaljeret teknikker til at isolere, kultur, karakterisere, og differentiere hMPCs fra skeletmuskulatur biopsi væv. På grundlag af tidligere arbejde, der beskrev hmpcs og identificerede potentielle celle overflade beslutningstagere for HMPC isolation^5,6, denne protokol fylder en kritisk kløft i viden ved at forbinde isolation til karakterisering af hmpcs. Desuden gør de detaljerede trin-for-trin instruktioner inkluderet i denne protokol hMPC isolation og karakterisering tilgængelig for en bred videnskabelig publikum, herunder dem med begrænset erfaring med hMPCs. Vores protokol er blandt de første til at beskrive brugen af et billedbehandlings-flowcytometer til at spore cellepopulationer. Nydesignede billedbehandlings cytometre er state-of-the-art, High-gennemløb, og Micro Plate-baseret, der muliggør Live Cell Imaging, celletælling, og multikanal fluorescens analyse af alle celler i hver brønd af et kultur fartøj inden for minutter. Dette system giver mulighed for hurtig kvantificering af dynamiske ændringer i spredningen og levedygtigheden af en hel cellepopulation med kun minimal forstyrrelse af kulturen. For eksempel er vi i stand til at udføre objektive foranstaltninger for sammenløbet på hinanden følgende dage in vitro til at bestemme vækst kinetik af hver kultur, der stammer fra forskellige donorer. Mange protokoller i litteraturen, især dem, der involverer differentiering af MPCs, kræver celler til at nå et defineret niveau af sammenløbet før påbegyndelse af differentiering eller behandling⁷. Vores metode giver mulighed for objektiv bestemmelse af sammenløbet af hver brønd i en kultur fartøj giver forskerne mulighed for at indlede behandling på en upartisk, ikke-subjektiv måde.

Tidligere var en væsentlig begrænsning af brugen af primære Hmpc’er lave udbytter, der begrænser antallet af celler, der er tilgængelige til eksperimenter. Vi og andre har vist udbyttet af MPCs fra skeletmuskulatur biopsi væv er 1 − 15 MPCs per milligram af væv (figur 1)⁸. Da vores protokol tillader fire passager i cellerne før rensning med fluorescens aktiverede celle sortering (FACS), er vores kryopræserverede HMPC-udbytter, der er afledt af små mængder biopsi-væv (50 − 100 mg), tilstrækkelige til at løse forskningsformål, hvor der kræves flere eksperimenter. Vores FACS-protokol producerer en ~ 80% ren (Pax7 positiv) MPC-population, således at vores protokol er optimeret til både udbytte og renhed.