蛍光相撲捕集タンパク質を用いた SUMO 修飾タンパク質の局在化

この方法の目的は、組換え相撲捕獲 UTAG (ULp ドメインタグ) タンパク質を用いて、相撲共役タンパク質の研究と分析を容易にすることである。以下に詳述するように、UTAG は、他の試薬の代わりに、相撲修飾タンパク質を精製、検出、および視覚化するためのアプローチを使用することができます。成長条件に応じて、細胞は、相撲または相撲の鎖で修飾された数百または数千のタンパク質を含むことができる (レビューのために Kerscher et al. 2006¹および Kerscher 2016²を参照)。これは、特に特定の sumoylation の標的の一部分のみが実際に改変された³であるため、特定の相撲修飾タンパク質の機能解析にとってかなりの困難を表している。転写調節、タンパク質の恒常性、細胞ストレスへの反応、有糸分裂と減数分裂の間のクロマチンのリモデリングなどの重要な細胞プロセスにおけるそれらの役割に加えて、;現在では、相撲、相撲改変タンパク質、および相撲の経路構成要素も、癌や神経変性疾患などの病理のためのバイオマーカーとして可能性があることが十分に明らかになっています^{4,5,6 、7}。これは、さまざまな細胞およびサンプルにおける相撲修飾タンパク質の検出と機能解析のための、堅牢で信頼性が高く、入手しやすいツールと革新的なアプローチの必要性を強調しています。

多くのシステムにおいて、相撲特異的抗体は、相撲修飾タンパク質^8,9の検出、分離および機能分析のための選択の試薬です。しかしながら、いくつかの商業的に入手可能な相撲特異的抗体は、高価であり、量または可用性において制限され、乱暴に可変親和性および交差反応性を示す傾向があり、そしていくつかの例では再現性¹⁰を欠く。別のアプローチとしては、形質転換された細胞や生物におけるエピトープタグ付き相撲の発現があるが、エピトープタグを相撲に結びつけることは、タンパク質標的¹¹への共役を人為的に下げる可能性がある。さらに、エピトープは、未変換の細胞または組織が評価される場合には有用ではない。

Ulp1 は、相撲前駆体と desumoylates 相撲共役タンパク質¹²の両方を処理するs. セレビシエから保存された相撲プロテアーゼである。UTAG 試薬は、Ulp1’s 相撲加工における触媒性システイン (C580S) の変異が相撲の切断を防ぐだけでなく、相撲共役タンパク質を高いものとして偶然という観測に基づいて開発されました。アビディティ¹².簡単にするために、我々は、UTAG (UD タグの略) として、このカルボキシ末端末端相撲トラッピング Ulp1 (C580S) 断片を言及しました。UTAG は、相撲修飾タンパク質の単離と検出に使用される、抗相撲抗体の有用な代替手段を表す組換え汎相撲の捕捉タンパク質である。重要なことに、それは具体的には、相撲の1つまたは複数のエピトープだけでなく、ネイティブに折り畳まれた相撲を認識しています。UTAG のタンパク質安定性と相撲の結合強度の両方を向上させるために、ストレス耐性酵母Kluyveromyces marxianus (Km) から UTAG の変種を生成した。KmUTAG は、相撲-コンジュゲートをナノモルアフィニティ¹³と緊密に結合します。さらに、kmUTAG は、高温 (42 ° c)、還元剤 (5 mM TCEP-トリス (2-carboxyethyl) 塩酸ホスフィン)、denaturants (最大 2 M 尿素)、酸化剤 (0.6% 過酸化水素)、および非イオン性洗剤に対して耐性があります。このストレス耐性は、過酷な浄化条件と長時間のインキュベーション時間の間に有益であり、その安定性と相撲捕獲活性を保証します。しかし、KmUTAG の相撲捕獲活動は、システイン修飾試薬やイオン性洗剤、完全に変性したタンパク質抽出物とは互換性がありません。KmUTAG の顕著な親和性および特性は、この試薬が複数の種に sumoylated タンパク質の研究のための標準的なレパートリーの一部となる可能性があることを示す。

ここでは、組換え蛍光 mCherry-KmUTAG 融合タンパク質 (kmUTAG) を使用して、哺乳動物細胞および線虫における相撲修飾タンパク質を検出する簡単な方法を提供します。